Флуоресцентность это: Флуоресценция — это что такое?

Люминесценция: виды, методы, применение. Термостимулированная люминесценция

Люминесценция – это излучение света определенными материалами в относительно холодном состоянии. Она отличается от излучения раскаленных тел, например горящего дерева или угля, расплавленного железа и проволоки, нагреваемой электрическим током. Излучение люминесценции наблюдается:

• в неоновых и люминесцентных лампах, телевизорах, радарах и экранах флюороскопов;
• в органических веществах, таких как люминол или люциферин в светлячках;
• в некоторых пигментах, используемых в наружной рекламе;
• при молнии и северном сиянии.

Во всех этих явлениях световое излучение не является результатом нагревания материала выше комнатной температуры, поэтому его называют холодным светом. Практическая ценность люминесцентных материалов заключается в их способности трансформировать невидимые формы энергии в видимое излучение.

Источники и процесс

Явление люминесценции происходит в результате поглощения материалом энергии, например, от источника ультрафиолетового или рентгеновского излучения, пучков электронов, химических реакций и т. д. Это приводит атомы вещества в возбужденное состояние. Так как оно неустойчиво, материал возвращается в свое исходное состояние, а поглощенная энергия выделяется в виде света и/или тепла. В процессе задействованы только внешние электроны. Эффективность люминесценции зависит от степени превращения энергии возбуждения в свет. Число материалов, обладающих достаточной для практического применения эффективностью, относительно небольшое.

Люминесценция и накаливание

Возбуждение люминесценции не связано с возбуждением атомов. Когда горячие материалы начинают светиться в результате накаливания, их атомы находятся в возбужденном состоянии. Хотя они вибрируют уже при комнатной температуре, этого достаточно, чтобы излучение происходило в дальней инфракрасной области спектра. С повышением температуры частота электромагнитного излучения смещается в видимую область. С другой стороны, при очень высоких температурах, которые создаются, например, в ударных трубах, столкновения атомов могут быть настолько сильными, что электроны отделяются от них и рекомбинируют, испуская свет. В этом случае люминесценция и накаливание становятся неразличимыми.

Люминесцентные пигменты и красители

Обычные пигменты и красители обладают цветом, так как они отражают ту часть спектра, которая комплементарна поглощенной. Небольшая часть энергии преобразуется в тепло, но заметного излучения не происходит. Если, однако, люминесцентный пигмент поглощает дневной свет на определенном участке спектра, он может излучать фотоны, отличающиеся от отраженных. Это происходит в результате процессов внутри молекулы красителя или пигмента, благодаря которым ультрафиолет может быть преобразован в видимый, например, синий свет. Такие методы люминесценции используются в наружной рекламе и в стиральных порошках. В последнем случае «осветлитель» остается в ткани не только для отражения белого, но и для преобразования ультрафиолетового излучения в синий цвет, компенсирующий желтизну и усиливающий белизну.

Ранние исследования

Хотя молнии, северное сияние и тусклое свечение светлячков и грибов всегда были известны человечеству, первые исследования люминесценции начались с синтетического материала, когда Винченцо Каскариоло, алхимик и сапожник из Болоньи (Италия), в 1603 г. нагрел смесь сульфата бария (в виде барита, тяжелого шпата) с углем. Порошок, полученный после охлаждения, ночью испускал голубоватое свечение, и Каскариоло заметил, что оно может быть восстановлено путем воздействия на порошок солнечного света. Вещество было названо «ляпис солярис», или солнечный камень, потому что алхимики надеялись, что оно способно превращать металлы в золото, символом которого является солнце. Послесвечение вызвало интерес многих ученых того периода, дававших материалу и другие названия, в том числе «фосфор», что означает «носитель света».

Сегодня название «фосфор» используется только для химического элемента, в то время как микрокристаллические люминесцирующие материалы называются люминофором. «Фосфор» Каскариоло, по-видимому, был сульфидом бария. Первым коммерчески доступным люминофором (1870 г.) стала «краска Бальмена» — раствор сульфида кальция. В 1866 году был описан первый стабильный люминофор из сульфида цинка – один из важнейших в современной технике.

Одно из первых научных исследований люминесценции, проявляющейся при гниении древесины или плоти и в светлячках, было выполнено в 1672 году английским ученым Робертом Бойлем, который, хотя и не знал о биохимическом происхождении этого света, тем не менее установил некоторые из основных свойств биолюминесцентных систем:

• свечение холодное;
• оно может быть подавлено такими химическими агентами, как спирт, соляная кислота и аммиак;
• излучение требует доступа к воздуху.

В 1885-1887 годах было замечено, что неочищенные экстракты, полученные из вест-индийских светлячков (огненосных щелкунов) и из моллюсков фолад, при смешивании производят свет.

Первыми эффективными хемилюминесцентными материалами были небиологические синтетические соединения, такие как люминола, открытая в 1928 году.

Хеми- и биолюминесценция

Большая часть энергии, выделяющейся в химических реакциях, особенно реакциях окисления, имеет форму тепла. В некоторых реакциях, однако, ее часть используется для возбуждения электронов до более высоких уровней, а во флуоресцентных молекулах до возникновения хемилюминесценции (ХЛ). Исследования показывают, что ХЛ является универсальным явлением, хотя интенсивность люминесценции бывает настолько мала, что требуется использование чувствительных детекторов. Есть, однако, некоторые соединения, которые демонстрируют яркую ХЛ. Наиболее известным из них является люминол, который при окислении пероксидом водорода может давать сильный синий или сине-зеленый свет. Другие сильные ХЛ-вещества – люцигенин и лофин. Несмотря на яркость их ХЛ, не все они эффективны при преобразовании химической энергии в световую, т. к. менее 1 % молекул излучают свет. В 1960-е годы было обнаружено, что сложные эфиры щавелевой кислоты, окисленные в безводных растворителях в присутствии сильно флуоресцирующих ароматических соединений, излучают яркий свет с эффективностью до 23 %.

Биолюминесценция представляет собой особый тип ХЛ, катализируемой ферментами. Выход люминесценции таких реакций может достигать 100 %, что означает, что каждая молекула реагирующего люциферина переходит в излучающее состояние. Все известные сегодня биолюминесцентные реакции катализируются реакциями окисления, протекающими в присутствии воздуха.

Термостимулированная люминесценция

Термолюминесценция означает не температурное излучение, но усиление светового излучения материалов, электроны которых возбуждены под действием тепла. Термостимулированная люминесценция наблюдается у некоторых минералов и прежде всего у кристаллофосфоров после того, как они были возбуждены светом.

Фотолюминесценция

Фотолюминесценция, которая возникает под действием электромагнитного излучения, падающего на вещество, может производиться в диапазоне от видимого света через ультрафиолетовый до рентгеновского и гамма-излучения. В люминесценции, вызванной фотонами, длина волны излучаемого света, как правило, равна или больше длины волны возбуждающего (т. е. равной или меньшей энергии). Эта разница в длине волны обусловлена ​​преобразованием поступающей энергии в колебания атомов или ионов. Иногда, при интенсивном воздействии лучом лазера, испускаемый свет может иметь более короткую длину волны.

Тот факт, что ФЛ может возбуждаться под действием ультрафиолетового излучения, был обнаружен немецким физиком Иоганном Риттером в 1801 г. Он заметил, что люминофоры ярко светятся в невидимой области за фиолетовой частью спектра, и таким образом открыл УФ-излучение. Превращение УФ в видимый свет имеет большое практическое значение.

Гамма- и рентгеновские лучи возбуждают кристаллические люминофоры и другие материалы до состояния люминесценции путем процесса ионизации с последующей рекомбинацией электронов и ионов, в результате чего и происходит люминесценция. Применение она находит во флюороскопах, используемых в рентгенодиагностике, и в сцинтилляционных счетчиках. Последние регистрируют и измеряют гамма-излучение, направленное на диск, покрытый люминофором, который находится в оптическом контакте с поверхностью фотоумножителя.

Триболюминесценция

Когда кристаллы некоторых веществ, например сахара, измельчаются, видны искры. То же наблюдается у многих органических и неорганических веществ. Все эти виды люминесценции порождаются положительными и отрицательными электрическими зарядами. Последние производятся за счет механического разделения поверхностей и в процессе кристаллизации. Световое излучение затем происходит путем разряда – либо непосредственного, между фрагментами молекул, либо через возбуждение люминесценции атмосферы вблизи отделенной поверхности.

Электролюминесценция

Как и термолюминесценция, термин электролюминесценция (ЭЛ) включает в себя разные виды люминесценции, общей чертой которых является то, что свет излучается при электрическом разряде в газах, жидкостях и твердых материалах. В 1752 г. Бенджамин Франклин установил люминесценцию молнии, вызванную электрическим разрядом через атмосферу. В 1860 году в Лондонском королевском обществе впервые была продемонстрирована разрядная лампа. Она производила яркий белый свет при разряде высокого напряжения через двуокись углерода при низком давлении. Современные люминесцентные лампы основаны на комбинации электролюминесценции и фотолюминесценции: атомы ртути в лампе возбуждаются электрическим разрядом, испускаемое ими ультрафиолетовое излучение преобразуется в видимый свет с помощью люминофора.

ЭЛ, наблюдаемая у электродов при электролизе, обусловлена ​​рекомбинацией ионов (следовательно, это своего рода хемилюминесценция). Под действием электрического поля в тонких слоях люминесцирующего сульфида цинка происходит излучение света, которое также называют электролюминесценцией.

Большое количество материалов испускает свечение под воздействием ускоренных электронов – алмаз, рубин, кристаллический фосфор и некоторые комплексные соли платины. Первое практическое применение катодолюминесценции – осциллограф (1897). Аналогичные экраны, использующие улучшенные кристаллические люминофоры, используются в телевизорах, радарах, осциллографах и электронных микроскопах.

Радиолюминесценция

Радиоактивные элементы могут испускать альфа-частицы (ядра гелия), электроны и гамма-лучи (высокоэнергетическое электромагнитное излучение). Радиационная люминесценция – это свечение, возбуждаемое радиоактивным веществом. Когда альфа-частицы бомбардируют кристаллический фосфор, под микроскопом видны крошечные мерцания. Этот принцип использовал английский физик Эрнест Резерфорд, чтобы доказать, что атом обладает центральным ядром. Самосветящиеся краски, используемые для маркировки часов и других инструментов, действуют на основе РЛ. Они состоят из люминофора и радиоактивного вещества, например трития или радия. Впечатляющая естественная люминесценция – это северное сияние: радиоактивные процессы на Солнце выбрасывают в пространство огромные массы электронов и ионов. Когда они приближаются к Земле, ее геомагнитное поле направляет их к полюсам. Газоразрядные процессы в верхних слоях атмосферы и создают знаменитые полярные сияния.

Люминесценция: физика процесса

Излучение видимого света (т. е. с длинами волн между 690 нм и 400 нм) требует энергии возбуждения, минимум которой определяется законом Эйнштейна. Энергия (Е) равна постоянной Планка (h), умноженной на частоту света (ν) или на его скорость в вакууме (с), деленную на длину волны (λ): E = hν = hc / λ.

Таким образом, энергия, необходимая для возбуждения, колеблется в пределах от 40 килокалорий (для красного) до 60 килокалорий (для желтого) и 80 килокалорий (для фиолетового) на моль вещества. Другой способ выражения энергии – через электрон-вольты (1 эВ = 1,6 × 10^-12 эрг) – от 1,8 до 3,1 эВ.

Энергия возбуждения передается электронам, ответственным за люминесценцию, которые перескакивают со своего основного энергетического уровня на более высокий. Эти состояния определяются законами квантовой механики. Различные механизмы возбуждения зависят от того, происходит ли оно в одиночных атомах и молекулах, в комбинациях молекул или в кристалле. Они инициируются посредством воздействия ускоренных частиц, таких как электроны, положительные ионы или фотоны.

Часто энергия возбуждения значительно выше необходимых для поднятия электрона до уровня излучения. Например, свечение кристаллов люминофора в телевизионных экранах производится катодными электронами со средними энергиями 25000 электрон-вольт. Тем не менее цвет люминесцентного света почти не зависит от энергии частиц. На него влияет уровень возбужденного состояния энергии кристаллических центров.

Люминесцентные лампы

Частицы, из-за которых возникает люминесценция, – это внешние электроны атомов или молекул. В люминесцентных лампах, например, атом ртути возбуждается под воздействием энергии 6,7 эВ или более, поднимая один из двух внешних электронов на более высокий уровень. После его возвращения в основное состояние разница в энергии излучается в виде ультрафиолетового света с длиной волны 185 нм. Переход между другим уровнем и базовым производит ультрафиолетовое излучение при 254 нм, которое, в свою очередь, может возбуждать другие люминофоры, генерирующие видимый свет.

Это излучение особенно интенсивно при низких давлениях паров ртути (10^-5 атмосферы), используемых в газоразрядных лампах низкого давления. Таким образом около 60 % энергии электронов преобразуется в монохроматический УФ-свет.

При высоком давлении частота увеличивается. Спектры больше не состоят из одной спектральной линии 254 нм, а энергия излучения распределена по спектральным линиям, соответствующим различным электронным уровням: 303, 313, 334, 366, 405, 436, 546 и 578 нм. Ртутные лампы высокого давления используют для освещения, так как 405–546 нм соответствуют видимому голубовато-зеленому свету, а при трансформации части излучения в красный свет с помощью люминофора в итоге получается белый.

Когда молекулы газа возбуждаются, их спектры люминесценции показывают широкие полосы; не только электроны поднимаются на уровни более высокой энергии, но одновременно возбуждаются колебательные и вращательные движения атомов в целом. Это происходит потому, что колебательные и вращательные энергии молекул составляют 10^-2 и 10^-4 от энергий переходов, которые, складываясь, образуют множество немного отличающихся длин волн, составляющих одну полосу. В более крупных молекулах есть несколько перекрывающих друг друга полос, по одной для каждого вида перехода. Излучение молекул в растворе преимущественно лентовидное, что вызвано взаимодействием относительно большого числа возбужденных молекул с молекулами растворителя. В молекулах, как и в атомах, в люминесценции участвуют внешние электроны молекулярных орбиталей.

Флуоресценция и фосфоресценция

Эти термины можно различать не только на основании длительности свечения, но и по способу его производства. Когда электрон возбуждается до синглетного состояния со сроком пребывания в нем 10^-8 с, из которого он может легко вернуться в основное, вещество излучает свою энергию в виде флуоресценции. Во время перехода спин не изменяется. Базовое и возбужденное состояния имеют подобную кратность.

Электрон, однако, можно поднять на более высокий энергетический уровень (называемый «возбужденное триплетное состояние») с обращением его спина. В квантовой механике переходы из триплетных состояний в синглетные запрещены, и, следовательно, время их жизни значительно больше. Поэтому люминесценция в этом случае имеет гораздо более длительный срок: наблюдается фосфоресценция.

Флуоресцентный белок miniSOG убивает клетки светом

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Развитие биологии не стоит на месте, и это ведёт к появлению всё более неожиданных инструментов и методов исследования биоматериала. Одним из таких инструментов являются фототоксические белки — генетически кодируемые молекулы, которые после облучения светом определённой волны производят губительные для клетки вещества. При этом они ещё и флуоресцируют: в ответ на облучение излучают свет с большей длиной волны, что позволяет легко их детектировать. Такие свойства делают фототоксические белки перспективными средствами как для молекулярно-биологических исследований, так и для медицинских разработок, в частности фотодинамической терапии раковых заболеваний.

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Лучший обзор».

---

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Развитие современной биологии способствует появлению новых и неожиданных методов исследования — как на молекулярном, так и на клеточном и организменном уровнях. Одним из таких методов является фототоксическое воздействие генетически кодируемых белков. Фототоксические вещества, или фотосенсибилизаторы, известны уже достаточно давно и применяются, например, в противораковой терапии. Однако направленная доставка молекул с такими свойствами в определённые клеточные органеллы открывает новые возможности для исследования клеточных процессов и развития новых способов терапии разнообразных, в том числе раковых, заболеваний.

История разработки фототоксических белков

Изучение и применение флуоресцентных белков давным-давно вышло за рамки специальных исследований. Флуоресценция — это процесс, при котором вещество при облучении светом с определённой длиной волны испускает свет с другой (большей) длиной волны. Флуоресцентные белки семейства GFP в настоящее время являются универсальным инструментом для мечения биологических молекул в живых клетках и даже в целых организмах. Родоначальником этой большой группы является, собственно, зелёный флуоресцентный белок GFP, выделенный из медузы

Aequorea Victoria японско-американским учёным Осаму Шимомура, удостоившимся за это открытие в 2008 году Нобелевской премии по химии [1–3]. Именно на основе этого белка учёными из лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии (Россия, Москва) был разработан фототоксический флуоресцентный белок KillerRed (следует отметить, что флуоресцентные белки изучают здесь и в лаборатории биофотоники, как мало где еще во всем мире). При облучении зелёным светом KillerRed производит перекись водорода, токсичную для клеток. Это делает его объектом не только медицинских прикладных исследований, но и инструментом для исследования внутриклеточных сигнальных путей с участием активных форм кислорода [4].

Совсем другое происхождение имеет фототоксический флуоресцентный белок miniSOG. Этот флуоресцентный белок генно-инженерными методами получен из домена рецептора синего света растений. В отличие от белков семейства GFP он содержит в своём составе молекулу небелкового происхождения (флавинмононуклеотид, постоянно присутствующих в живых клетках; рис. 1). Ещё одно важное отличие состоит в том, что при облучении синим светом miniSOG производит синглетный кислород, чрезвычайно токсичный для клеток [5].

Рисунок 1. Предполагаемые пространственные структуры белка miniSOG и его активного центра

Фототоксическое влияние miniSOG на клетки

Сочетание всех этих свойств делает miniSOG весьма интересным как для молекулярно-биологических манипуляций, так и для прикладных исследований. Его токсичность для клеток может быть использована в противораковой фотодинамической терапии. Фотодинамическая терапия — это способ лечения раковых заболеваний, использующий сочетание молекул фотосенсибилизаторов и видимого света и вызывающий гибель раковых клеток.

Именно поэтому изучение влияния miniSOG в различных органеллах на жизнеспособность клеток представляется весьма перспективным. Такие исследования были проведены в уже упоминавшемся Институте биоорганической химии. В этой работе исследовались клетки, имеющие белок miniSOG в митохондриях, ядре или на мембране (рис. 2). Было показано, что клетки, которые образуют miniSOG, после облучения синим светом погибают. Причём наибольшая вероятность гибели из трёх исследованных органелл была достигнута в случае связанного с мембраной белка и достигала 90%. Кроме того, для разных органелл, содержащих miniSOG, отличался и способ клеточной гибели. Так, например, для «митохондриального» и «ядерного» miniSOG был свойственен апоптоз (запрограммированное клеточное «самоубийство», рис. 3), а для мембранного — некроз (клеточная гибель, приводящая к последующему воспалительному процессу).

Рисунок 2. Экспрессия фотосенсибилизатора miniSOG в митохондриях (а), ядре (б) и на плазматической мембране (в)

Рисунок 3. Апоптотическая гибель клеток HeLaKyoto, содержащих miniSOG в митохондриях. Видны специфические для апоптоза пузырьковые структуры.

Следует отметить, что miniSOG вызывает достаточно серьёзные повреждения в клетке. Например, было показано, что после облучения синим светом клеток, содержащих miniSOG в ядре, начинается сборка восстанавливающих структуру ДНК комплексов с участием белка XRCC1 (одного из ключевых компонентов в процессе репарации ДНК). Такие комплексы не образуются ни до, ни после облучения, если в клетке отсутствует miniSOG (рис. 4).

Рисунок 4. Образование репарационных комплексов на ДНК с участием белка XRCC1 после облучения синим светом клеток, содержащих miniSOG в ядре (

а — клетка до облучения; б — после облучения). Представлены клетки без miniSOG до (в) и после (г) облучения.

Таким образом, miniSOG является эффективным генетически кодируемым фотосенсибилизатором, вызывающим гибель клеток в ответ на облучение. У клеток появляется новое свойство — «светобоязнь»: уязвимость к излучению видимого спектра, в норме безвредного как для отдельных клеток, так и для целых организмов. Это делает miniSOG незаменимым молекулярно-биологическим инструментом в генно-инженерных исследованиях и медицинских разработках.

Фотодинамическая терапия

Естественно, возникает желание применять miniSOG и в фотодинамической терапии раковых заболеваний. Однако здесь следует упомянуть существенные недостатки уже используемых в настоящее время фотосенсибилизаторов химической природы. Наиболее важным является то, что такие фотосенсибилизаторы невозможно доставить только в опухоль. Они оказываются распространёнными по всему организму, хотя в ряде исследований было показано их преимущественное накопление в опухоли. Поэтому для человека, подвергшегося фотодинамической терапии, в течение длительного времени нахождение на солнце, да и вообще в освещённом месте является вредным и болезненным. Кроме того, накопление химических фотосенсибилизаторов происходит во всех органеллах клетки. Этот фактор делает сложным предсказание способа гибели клеток. А, как уже было сказано выше, гибель клеток путём некроза вызывает серьёзные воспалительные реакции, совсем не нужные пациенту в тяжёлом состоянии.

Безусловно, такие проблемы могут быть решены с использованием генетически направленных фотосенсибилизаторов (miniSOG, KillerRed). Прикрепив к последовательности гена фототоксического белка последовательность, характерную для конкретной органеллы, можно обеспечить накопление фотосенсибилизатора в желаемой органелле. Такой способ позволяет строго контролировать распространение фототоксического белка в клетке.

Другая задача — это обеспечить доставку фотосенсибилизатора именно в раковую клетку и только в неё. В настоящее время этого можно достичь с использованием вирусных частиц направленной доставки. Суть данного метода заключается в следующем. Во-первых, используются вирусные частицы, у которых удалена значительная часть генома, что делает их неспособными к размножению. Это обеспечивает безопасность использования вирусных препаратов. Во-вторых, вирусная частица несёт в своём составе ген фотосенсибилизатора, что и обеспечивает фототоксичность при фотодинамической терапии. И, наконец, в-третьих, такие частицы имеют на своей поверхности молекулы антител к молекулам антигенов, присутствующих на плазматической мембране только раковых клеток. Это обеспечивает направленность.

Однако здесь следует отметить, что в настоящее время не для каждой формы рака известен специфический антиген, и обнаружить его не так просто, поскольку антигенная структура раковой клетки может быть слишком разнородна или, напротив, не отличаться от здоровой клетки. Уже известно, что клетки рака молочной железы и некоторых других типов имеют на своей поверхности молекулы HER2 (human epidermal growth factor receptor 2, человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2). Клетки опухоли щитовидной железы имеют рецепторы фактора роста эндотелия сосудов, клетки метастазирующей меланомы — постоянно активированную мутантную форму серин/треониновой киназы BRAF и т.д. Кроме того, на основе имеющихся данных об известных опухолевых антигенах разрабатываются методы направленной доставки к раковым клеткам липосом и полимерных капсул, содержащих цитотоксические вещества [6]. Но такая доставка оказывается недостаточно эффективной, и осуществлять её следует многократно. Предполагается, что данную проблему может помочь решить генетически кодируемый фотосенсибилизатор, доставленный в раковую клетку с помощью направленных вирусных частиц.

Всё это делает применение генетически кодируемых фотосенсибилизаторов в сочетании с вирусными частицами направленной доставки очень привлекательным для противораковой терапии. Однако данный метод должен быть более точно и тонко разработан, прежде чем его можно будет применять для лечения. Но сама по себе возможность такого подхода таит в себе большие перспективы. Ведь вполне возможно, что в недалёком будущем люди научатся лечить раковые заболевания солнечным лучом.

1. Osamu Shimomura. (2009). Discovery of Green Fluorescent Protein (GFP) (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed.. 48, 5590-5602;
2. Dmitriy M. Chudakov, Sergey Lukyanov, Konstantin A. Lukyanov. (2005). Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23, 605-613;
3. Флуоресцирующая Нобелевская премия по химии;
4. Maria E Bulina, Dmitriy M Chudakov, Olga V Britanova, Yurii G Yanushevich, Dmitry B Staroverov, et. al.. (2006). A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol. 24, 95-99;
5. Xiaokun Shu, Varda Lev-Ram, Thomas J. Deerinck, Yingchuan Qi, Ericka B. Ramko, et. al.. (2011). A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biol. 9, e1001041;
6. Angus P. R. Johnston, Marloes M. J. Kamphuis, Georgina K. Such, Andrew M. Scott, Edouard C. Nice, et. al.. (2012). Targeting Cancer Cells: Controlling the Binding and Internalization of Antibody-Functionalized Capsules. ACS Nano. 6, 6667-6674.

Флуоресценция алмазов: 11 мифов и фактов о свечении

Приветствуем всех кто заглянул к нам в гости, у бриллианта помимо основных характеристик (масса, чистота, цвет, качество огранки), влияющих на его стоимость, есть немаловажный параметр – флуоресценция. Это способность камня светиться разными оттенками с разной интенсивностью в ультрафиолетовых лучах.

Разные степени флуоресценции у бриллианта.

Существует много мнений и плюсах и минусах данной особенности бриллианта, сегодня мы рассмотрим несколько распространенных мифов и постараемся их развеять.

Миф первый: все бриллианты имеют свечение.

Факт: Большинство бриллиантов не имеют свечения, лаборатория GIA провела исследование более 20 000 алмазов и только 25% — 35% всех камней имели ту или иную степень флуоресценции.

Миф второй: флуоресценцию алмаза можно увидеть независимо от освещения.

Факт: На самом деле свечение проявляется под воздействием ультрафиолетовых, рентгеновских лучей и лазеров. Так же флуоресценцию можно увидеть при ярком солнечном освещении, от ламп в солярии, ночном клубе и других местах, где присутствует ярких флуоресцентный свет. Но стоит убрать источник света и алмаз сразу перестает светиться. А вот обычная лампа не вызывает свечение.

Если смотреть при свете лампы накаливания, все бриллианты в этих серьгах кажутся одного цвета. Источник: GIA

При просмотре в УФ-лампе алмазы в серьгах показывают разную степень флуоресценции алмаза. Источник: GIA

Миф третий: флуоресценция всегда может быть обнаружена

Факт: Алмазная флуоресценция не всегда может быть обнаружена. Нужны условия, в которых присутствуют ультрафиолетовые лучи, а интенсивность флуоресценции достаточно сильная, чтобы ее можно было наблюдать.

Миф четвертый: Флуоресценция бриллианта влияет на оценку цвета бриллианта.

Факт: Присваивая цвет бриллианту, лаборатория GIA исследует драгоценный камень в высоко-контролируемой среде просмотра, предназначенной для минимизации влияния флуоресценции и для получения точной и объективной оценки цвета бриллианта.

На то, как будет восприниматься цветовая оценка бриллианта, может повлиять степень его флуоресценции — в положительном смысле. У алмаза с желтым оттенком голубая флуоресценция, от умеренной до сильной, может нейтрализовать часть желтизны и визуально улучшить его цвет, чем покажет его цветовая градация. См. Миф №7.

Миф пятый: флуоресценция алмаза присваивается оценка на ровне с цветом, чистотой и огранкой.

Факт: флуоресценция алмаза не входит в правило 4С оценки алмазов (вес, цвет, чистота, огранка). Флуоресценция считается отличительной характеристикой — дополнительной информацией, которая помогает отличить один алмаз от другого и указывается в сертификате на бриллиант.

Красным подчеркнут параметр флюоресценции, как видно он не попадает в 4C

GIA в своих отчетах о классификации алмазов описывают интенсивность флуоресценции как; None (отсуствует), Faint (слабая), Medium (средняя), Strong (сильная) и Very Strong (очень сильная).

Миф шестой: у алмазов исключительно синее свечение.

Факт: Бриллианты могут флюоресцировать в различных цветах. К ним относятся оранжево-желтый, желтый, оранжевый, красный, белый и зеленый. Изменения в атомной структуре, такие как количество присутствующих атомов азота, вызывают это явление. Синий цвет, однако, на сегодняшний день является наиболее распространенным цветом алмазной флуоресценции.

Эти необработанные алмазы демонстрируют различные цвета при воздействии ультрафиолета. Источник: GIA

Миф седьмой: сильная голубая флуоресценция – это плохо

Факт: GIA изучили влияние голубой флуоресценции на внешний вид бриллианта при обычных условиях просмотра. Было обнаружено что, обычные покупатели ювелирных украшения не могут различить какие-либо эффекты, связанные с флуоресценцией, в условиях в которых приобретаются и носят ювелирные украшения.

Однако было также обнаружено, что сильная флуоресценция голубого алмаза может быть полезной. Результаты этого исследования показали, что, как отмечалось в Мифе № 4, некоторые ярко-синие флуоресцентные бриллианты воспринимались как имеющие более высокий показатель цвета.

Источник: GIA

Миф восьмой: Флуоресценция снижает блеск и красоту камня

Факт: Флуоресценция практически никак не влияет на блеск алмаза, а тем более на красоту камня. «Игра» камня в первую очередь определяется качеством его огранки. Огранка алмаза — то есть углы и относительные размеры его граней, а также другие его пропорции — определяет, насколько хорошо свет попадает в бриллиант, отражается от его граней и выходит через площадку.

Миф девятый: флуоресценция подтверждение природного происхождения алмаза

Факт: Это не так. Наличие или отсутствие флуоресценции не следует использовать в качестве самостоятельного теста, чтобы определить, настоящий ли ваш бриллиант . Во-первых, не все природные алмазы флуоресцируют под воздействием стандартной УФ-лампы, используемой геммологами (см. Миф № 1).

Во-вторых, некоторые синтетические алмазы могут флуоресцировать. Различия в интенсивности, цвете и характере флуоресценции природных и синтетических алмазов безусловно есть, но бывают и совпадения. Некоторые материалы, используемые для имитации алмаза, к примеру цирконий, могут демонстрировать флуоресценцию.

Синтетические алмазы, полученные методом химического осаждения из паровой фазы, могут демонстрировать сильную розовато-оранжевую флуоресценцию (среди других цветов) с участками сильного синего или фиолетового цвета при воздействии высокоинтенсивных ультракоротких волн. Источник: Wuyi Wang / GIA

Миф десятый: флуоресценция делает алмаз более хрупким

Факт: флуоресцирующий под стандартной УФ-лампой алмаз, имеет такую же структурную целостность, что и алмаз, не имеющий свечения. Ничто в субмикроскопических структурах, вызывающих флуоресценцию, не ослабляет алмаз.

Миф одиннадцатый: флуоресценция алмаза влияет на стоимость.

Факт: Мнения специалистов расходятся в вопросе, увеличивает или уменьшает стоимость бриллианта флуоресценция. Кто-то считает что сильная синяя флуоресценция снижает стоимость алмаза, поскольку влияет на прозрачность, делая его более мутным. И наоборот, кто-то платит более высокие цены за синие флуоресцирующие бриллианты более низкой цветовой гаммы, потому что, как отмечалось выше, они считают, что флуоресценция маскирует слабый светло-желтый оттенок этих бриллиантов.

Флуоресценция бриллиантов и ее влияние на стоимость — это не простой вопрос, и на него нет однозначного ответа. Мы рекомендуем вам сравнить бриллианты в различных световых условиях и выбрать тот камень, который вам больше всего нравится.

Всем спасибо за внимние!

Светящиеся в темноте материалы, как это работает (краски, рисунки, предметы)

Характеристики красок и лаков

Данные характеристики подходят под типы всех лаков и красок

Краски подразделяются на 3 вида. Люминесцентные, Флуоресцентные, смешанные (люминесцентно — флуоресцентные)

1) Люминесцентные – самые ярко светящиеся в темноте краски белого с зеленоватым или голубоватым оттенком и прозрачные лаки с такими же оттенками. Отличаются повышенным свечением в темное и средней темноты среде. Время свечения 5-8 часов, наиболее яркое свечение в течении первых 2х часов. Для зарядки нужен яркий свет, лучше всего солнечный, можно и искусственный. Краски ИМЕНННО ЗАРЯЖАЮТСЯ т.е. чем дольше изделия покрашенные краской (просто краска или лак) будут на свету, тем дольше и ярче изделие будет светится. Среднее время заряда 1-2 часа.

2) Флуоресцентные – краски светящиеся только при УФ лучах. Чем ближе к источнику УФ лучей, тем ярче свечение. Разных цветов. Не требуют заряда.

3) Смешанные (люминесцентно — флуоресцентные) Краски разных цветов светящиеся в темноте и при УФ лучах. Время и степень заряда и свечения в темноте такое же (или чуть меньше при применении темных цветов в краске)

Как пользоваться Люминесцентной иили флуоресцентной краской по ткани

1) В зависимости от вашей цели нанести краску удобным для вас способом:

— на шнурки полностью, вдавливая краску в изделие

— для рисунка на футболке любым способом (трафаретный, свободное рисование) ВАЖНО не рисуйте рамки рисунка контрастными цветами, они будут видны под высохшей краской

Подождать полного высыхания (в зависимости от количества слоев, 1 слой сохнет 1-1,5 часа)

Оставить закрепляться на 1-2 суток

2) Далее вам нужно термозакрепить краску, для этого через ненужную ткань, чтоб не повредить эмаль утюга не закрепившейся краской проглаживаем изделие утюгом на высокой температуре. Гладить около 2х минут, если краска пропиталась, то с 2х сторон изделия (если это возможно). Если изделие прогладить трудно, то прогреть феном.

3) Затем нужно смыть остатки не закрепившейся краски и заодно смягчить изделие (до этого оно скорее в большинстве случаев грубое, так как краска схватилась + глажка утюгом) Моем изделие в теплой, проточной т.е. под краном, можно применить кондиционер (для мягкости) мыть около 3х минут, пока вода станет минимально окрашиваться.

4) Просушить, если нужно еще раз прогладить.

Готово!!

Дальнейшие инструкции к носке и применению и носке.

Если вы прокрашивали все нашей специальной светящейся красой для ткани фирмы «свет в темноте» , ничего самостоятельно не примешивая и не меняя рецептуру, то у вас получилось изделие светящееся в темноте, в течении срока службы самой вещи которое не требует особого ухода (как обычные магазинные вещи) стирать можно и нужно но для сохранения цвета и долговечности рекомендуется стирать в ручную.

Инструкции к общей светящейся краске и лакам

Так же как и ко всем изделиям эта краска больше подойдет для белой или прозрачной поверхности, чем темнее изделие, тем тусклее свечение.

Окрашивайте ваши изделия так же как вы окрашивали,бы их обычной краской. Особых инструкций нет.

Время свечения 5-8 часов, наиболее яркое свечение в течении первых 2х часов. Для зарядки нужен яркий свет, лучше всего солнечный, можно и искусственный. Краски ИМЕНННО ЗАРЯЖАЮТСЯ т.е. чем дольше изделия покрашенные краской (просто краска или лак) будут на свету, тем дольше и ярче изделие будет светится. Среднее время заряда 1-2 часа. Если вы используете флуоресцентные или смешанные краски то смотрите их характеристики выше.

Инструкция к краски по телу

Характеристики зависят от вида краски (Люминесцентные, Флуоресцентные, смешанные (люминесцентно — флуоресцентные) вид указан на упаковке. Наносить как обычный грим. Но беречь одежду. Светящийся пигмент может не смытся полностью (прочем при дневном освещении вы этого не земетите)

Инструкция к краске по цветам

Наносить на верхние (видимые) лепестки и на сердцевину цветка. Покрытие должно быть среднее (не тонким слоем, но и не накладывать много слоев, иначе краска не просохнет и не станет прозрачной) Если вы не уверенны в качестве нанесения, нанесите тонкий слой при ярком освещении, отнесите цветок в темноту и посмотрите достаточно ли ярко светится, если нет, нанесите еще один слой. Краска высохнет и исчезнет за 1-2 часа.

Спрей распылить по цветку предварительно защитив окружающие предметы или делать это в специально оборудованном месте. Не распылять густо, иначе спрей до высыхания скатится с цветков. Время высыхания 1-2 часа.

Флуоресценция — Chemistry LibreTexts

Флуоресценция, вид люминесценции, возникает в газовых, жидких или твердых химических системах. Флуоресценция вызывается поглощением фотонов в синглетном основном состоянии, переходящем в синглетное возбужденное состояние. В отличие от фосфоресценции спин электрона по-прежнему связан с электроном в основном состоянии. Когда возбужденная молекула возвращается в основное состояние, происходит испускание фотона с меньшей энергией, что соответствует большей длине волны, чем поглощенный фотон.

Введение

Потеря энергии связана с колебательной релаксацией в возбужденном состоянии. Флуоресцентные полосы сосредоточены на длинах волн, превышающих длину резонансной линии. Этот сдвиг в сторону более длинных волн называется стоксовым сдвигом. Возбужденные состояния недолговечны с временем жизни около 10 ^-8 секунд. Молекулярная структура и химическая среда влияют на то, люминесцирует ли вещество. Когда люминесценция действительно происходит, молекулярная структура и химическое окружение определяют интенсивность излучения.Обычно флуоресцирующие молекулы представляют собой сопряженные системы. Флуоресценция возникает, когда атом или молекулы релаксируют посредством колебательной релаксации до своего основного состояния после электрического возбуждения. Конкретные частоты возбуждения и излучения зависят от молекулы или атома.

\ [S_0 + h \ nu_ {ex} = S_1 \]

где

• \ (h \ nu \) — энергия фотона с
• \ (h \) — постоянная Планка, а
• \ (\ nu \) — частота света,
• \ (S_0 \) — основное состояние флуорофора, а
• \ (S_1 \) — его первое электронно-возбужденное состояние.

Рис. 1. Диаграмма Яблонского поглощения, безызлучательного распада и флуоресценции. (Public Domain, Jacobkhed)

На рисунке 1 представлена ​​энергетическая диаграмма Яблонски, представляющая флуоресценцию. Фиолетовая стрелка обозначает поглощение света. Зеленая стрелка представляет колебательную релаксацию из синглетного возбужденного состояния, от S ₂ до S ₁ . Этот процесс представляет собой безызлучательную релаксацию, при которой энергия возбуждения рассеивается в виде колебаний или тепла в растворителе, а фотон не испускается.Желтая стрелка представляет собой флуоресценцию синглетного основного состояния, S _o .

Квантовый выход флуоресценции ((\ Phi \)) показывает эффективность процесса флуоресценции. Это отношение излучаемых фотонов к поглощенным фотонам.

\ [\ Phi = \ dfrac {\ text {# испускаемых фотонов}} {\ text {# поглощенных фотонов}} \ label {Eq0} \]

Если каждый поглощенный фотон приводит к испусканию фотона. Максимальный квантовый выход флуоресценции составляет 1,0, а соединения с квантовым выходом 0.10 по-прежнему считаются флуоресцентными. Другой способ определить квантовый выход флуоресценции — это скорость распада возбужденного состояния:

\ [\ Phi = \ dfrac {k_f} {\ sum_i k_i} \ label {Eq1} \]

где \ (k_f \) — это скорость спонтанного излучения излучения, а знаменатель — это сумма всех скоростей распада возбужденного состояния для каждого процесса дезактивации (т.е. фосфоресценции, межсистемного пересечения, внутреннего преобразования…). Время жизни флуоресценции — это среднее время, в течение которого молекула остается в возбужденном состоянии перед испусканием фотона.{- t / \ tau} \ label {Eq2} \]

где

• \ ([S_1] \) — концентрация молекул в возбужденном состоянии в момент времени \ (t \),
• \ ([S_1] _0 \) — начальная концентрация, а \ (\ tau \) — скорость распада.

Различные радиационные и неизлучающие процессы могут освободить возбужденное состояние, так что общая скорость распада является суммой по всем скоростям:

\ [\ tau_ {tot} = \ tau_ {rad} + \ tau_ {nrad} \ label {Eq3} \]

где \ (\ tau_ {tot} \) — полная скорость распада, \ (\ tau_ {rad} \) скорость радиационного распада и \ (\ tau_ {nrad} \) скорость безызлучательного распада. {x} \ приблизительно 1 + x +… \]

, поэтому уравнение \ (\ ref {Eq4} \) можно упростить до

\ [I_f = kI_o \ Phi [εbc] \ label {Eq4a} \]

Это соотношение показывает, что интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации.

Флуоресценция редко возникает в результате поглощения УФ-излучения с длинами волн короче 250 нм, потому что этот тип излучения достаточно энергичен, чтобы вызвать дезактивацию возбужденного состояния путем предиссоциации или диссоциации. Большинство органических молекул имеют по крайней мере некоторые связи, которые могут быть разорваны энергией такой силы.* \ rightarrow \ pi \), потому что эти возбужденные состояния показывают короткое среднее время жизни (большее \ (k_f \)) и потому, что процессы дезактивации, которые конкурируют с флуоресценцией, не так вероятны. Молярная поглощающая способность переходов π → π * в 100–1000 раз больше. Среднее время жизни составляет от 10 ^-7 до 10 ^-9 секунд для состояний?,? * И от 10 ^-5 до 10 ^-7 секунд для состояний n, π *.

Рисунок 2: Схематическое изображение флуоресцентного спектрометра.из OpenStax (CC-BY-3.0)

На рис. 2 представлена ​​схема типичного флуориметра с фильтром, в котором для возбуждения флуоресценции используется пучок источника и пара фотоумножителей в качестве преобразователей. Луч источника разделяется рядом с источником на опорный луч и образец луча. Опорный луч ослабляется апертурным диском, так что его интенсивность примерно равна интенсивности флуоресценции. Оба луча проходят через первичный фильтр, при этом опорный луч отражается на опорную трубку фотоумножителя.Луч образца фокусируется на образце парой линз и вызывает испускание флуоресценции. Испускаемое излучение проходит через второй фильтр и затем фокусируется на фотоэлектронном умножителе образца. Электрические выходные сигналы двух преобразователей затем обрабатываются аналого-цифровым преобразователем для вычисления отношения интенсивности образца к эталонной интенсивности, которое затем может использоваться для качественного и количественного анализа. Для получения спектра излучения монохроматор возбуждения фиксируется, а монохроматор излучения изменяется.Для получения спектра возбуждения монохроматор возбуждения изменяется, а монохроматор излучения фиксируется.

Флуоресцентная спектроскопия может использоваться для измерения концентрации соединения, поскольку интенсивность флуоресценции линейно пропорциональна концентрации флуоресцентной молекулы. Флуоресцентные молекулы также можно использовать в качестве меток. Например, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это метод определения того, какие гены присутствуют в геноме организма. Одноцепочечная ДНК, кодирующая интересующий ген, ковалентно связана с флуоресцентной молекулой и промывается по хромосоме организма, связываясь с ее комплементарной последовательностью.Присутствие и размещение гена в организме затем флуоресцирует при освещении ультрафиолетовым светом. Белок зеленой флуоресценции (GFP) используется в молекулярной биологии для контроля активности белков. Ген, кодирующий GFP, может быть вставлен рядом с геном, кодирующим белок, который будет изучаться. Когда гены экспрессируются, белок присоединяется к GFP и может быть идентифицирован в клетке по его флуоресценции.

Праймер для микроскопии молекулярных выражений

: специализированные методы микроскопии — флуоресценция

Флуоресцентная микроскопия

Основные понятия флуоресценции

Флуоресценция является членом повсеместно распространенного семейства процессов люминесценции , в которых восприимчивые молекулы излучают свет из электронно-возбужденных состояний, создаваемых физическим (например, поглощение света), механическим (трение) или химическим механизмом.Генерация люминесценции путем возбуждения молекулы фотонами ультрафиолетового или видимого света представляет собой явление, называемое фотолюминесценцией , которое формально делится на две категории: флуоресценция и фосфоресценция , в зависимости от электронной конфигурации возбужденного состояния и излучения. путь. Флуоресценция — это свойство некоторых атомов и молекул поглощать свет с определенной длиной волны и впоследствии излучать свет с большей длиной волны через короткий промежуток времени, называемый временем жизни флуоресценции.Процесс фосфоресценции происходит аналогично флуоресценции, но с гораздо более длительным временем жизни возбужденного состояния.

Процесс флуоресценции регулируется тремя важными событиями, все из которых происходят во временных масштабах, разделенных несколькими порядками величины (см. Таблицу 1). Возбуждение восприимчивой молекулы входящим фотоном происходит за фемтосекунды (10E-15 секунд), в то время как колебательная релаксация электронов возбужденного состояния до самого низкого энергетического уровня происходит намного медленнее и может быть измерена в пикосекундах (10E-12 секунд).Последний процесс, испускание фотона с большей длиной волны и возвращение молекулы в основное состояние, происходит за относительно длительный период времени в наносекунды (10E-9 секунд). Хотя все время жизни молекулярной флуоресценции, от возбуждения до испускания, измеряется всего за миллиардные доли секунды, это явление является ошеломляющим проявлением взаимодействия между светом и веществом, которое формирует основу для обширных полей стационарного состояния и флуоресценции с временным разрешением. спектроскопия и микроскопия.Благодаря чрезвычайно чувствительным профилям излучения, пространственному разрешению и высокой специфичности флуоресцентных исследований этот метод быстро становится важным инструментом в генетике и клеточной биологии.

Несколько исследователей сообщили о явлениях люминесценции в течение семнадцатого и восемнадцатого веков, но именно британский ученый сэр Джордж Г. Стоукс впервые описал флуоресценцию в 1852 году и ввел термин в честь сине-белого флуоресцентного минерала флюорита (плавиковый шпат).Стокс также обнаружил сдвиг длины волны к более длинным значениям в спектрах излучения, который носит его имя. Флуоресценция впервые была обнаружена в оптической микроскопии в начале двадцатого века несколькими известными учеными, в том числе Августом Клером и Карлом Райхертом, которые первоначально сообщили, что флуоресценция мешает ультрафиолетовой микроскопии. Первые флуоресцентные микроскопы были разработаны в период с 1911 по 1913 год немецкими физиками Отто Хеймстдтом и Генрихом Леманом в качестве побочного продукта ультрафиолетового прибора.Эти микроскопы использовались для наблюдения автофлуоресценции в тканях бактерий, животных и растений. Вскоре после этого Станислав фон Провазек открыл новую эру, когда он использовал флуоресцентную микроскопию для изучения связывания красителя в фиксированных тканях и живых клетках. Однако только в начале 1940-х годов Альберт Кунс разработал метод маркировки антител флуоресцентными красителями, что положило начало области иммунофлуоресценции. На рубеже двадцать первого века область флуоресцентной микроскопии произвела революцию в клеточной биологии, объединив возможности визуализации живых клеток с высокоспецифичным множественным мечениями отдельных органелл и макромолекулярных комплексов с помощью синтетических и генетически кодируемых флуоресцентных зондов.

Диапазон шкалы времени для процессов флуоресценции

Переход Процесс Константа скорости Шкала времени (секунды) S (0) => S (1) или S (n) Поглощение (возбуждение) Мгновенный 10 -15 S (n) => S (1) Внутреннее преобразование к (ic) 10 -14 до 10 -10 S (1) => S (1) Вибрационная релаксация к (vr) 10 -12 до 10 -10 S (1) => S (0) Флуоресценция k (ж) или G 10 -9 до 10 -7 S (1) => T (1) Межсистемный переход к (пТ) 10 -10 -10 -8 S (1) => S (0) Безызлучательная релаксация Тушение к (кол), к (к) 10 -7 до 10 -5 Т (1) => S (0) Фосфоресценция к (п) 10 -3 до 100 Т (1) => S (0) Безызлучательная релаксация Тушение к (кол), к (qT) 10 -3 до 100

Таблица 1

Флуоресценция обычно изучается на сильно сопряженных полициклических ароматических молекулах, которые существуют на любом из нескольких энергетических уровней в основном состоянии, каждый из которых связан с определенным расположением электронных молекулярных орбиталей.Электронное состояние молекулы определяет распределение отрицательного заряда и общую геометрию молекулы. Для любой конкретной молекулы существует несколько различных электронных состояний (показано как S (0) , S (1) и S (2) на рисунке 1), в зависимости от полной энергии электронов и симметрии различных электронные спиновые состояния. Каждое электронное состояние далее подразделяется на ряд уровней колебательной и вращательной энергии, связанных с атомными ядрами и связывающими орбиталями.Основное состояние для большинства органических молекул — это электронный синглет, в котором все электроны спарены (имеют противоположные спины). При комнатной температуре очень немногие молекулы обладают достаточной внутренней энергией, чтобы существовать в любом состоянии, кроме самого нижнего колебательного уровня основного состояния, и, таким образом, процессы возбуждения обычно происходят на этом уровне энергии.

Категория молекул, способных претерпевать электронные переходы, которые в конечном итоге приводят к флуоресценции, известны как флуоресцентные зонды , флуорохромы или просто красители .Флуорохромы, которые конъюгированы с более крупной макромолекулой (такой как нуклеиновая кислота, липид, фермент или белок) посредством адсорбции или ковалентных связей, называются флуорофорами . В общем, флуорофоры делятся на два широких класса: внутренний и внешний . Собственные флуорофоры, такие как ароматические аминокислоты, нейротрансмиттеры, порфирины и зеленый флуоресцентный белок, встречаются в природе. Внешние флуорофоры — это синтетические красители или модифицированные биохимические вещества, которые добавляют в образец для получения флуоресценции с определенными спектральными свойствами.

Поглощение, возбуждение и излучение

Поглощение энергии флуорохромами происходит между близко расположенными колебательными и вращательными уровнями энергии возбужденных состояний на разных молекулярных орбиталях. Различные уровни энергии, участвующие в поглощении и излучении света флуорофором, классически представлены энергетической диаграммой Яблонского (см. Рис. 1), названной в честь польского физика профессора Александра Яблонского.Типичная диаграмма Яблонского иллюстрирует синглетное основное ( S (0) ) состояние, а также первое ( S (1) ) и второе ( S (2) ) возбужденные синглетные состояния в виде набора горизонтальных линий. . На рисунке 1 более толстые линии представляют электронные уровни энергии, а более тонкие линии обозначают различные колебательные энергетические состояния (состояния вращательной энергии не учитываются). Переходы между состояниями показаны как прямые или волнистые стрелки, в зависимости от того, связан ли переход с поглощением или испусканием фотона (прямая стрелка) или является результатом молекулярного внутреннего преобразования или процесса безызлучательной релаксации (волнистые стрелки).Вертикальные стрелки вверх используются для обозначения мгновенного характера процессов возбуждения, в то время как волнистые стрелки зарезервированы для тех событий, которые происходят в гораздо более длительном масштабе времени.

Поглощение света происходит очень быстро (примерно фемтосекунда, время, необходимое фотону для прохождения одной длины волны) дискретными количествами, называемыми квантами , и соответствует возбуждению флуорофора из основного состояния в возбужденное состояние. Точно так же испускание фотона через флуоресценцию или фосфоресценцию также измеряется в квантах.Энергия в кванте ( Закон Планка ) выражается уравнением:

E = hn = hc / l

, где E — энергия, h — постоянная Планка, n и l — частота и длина волны входящего фотона, а c — скорость света. Закон Планка гласит, что энергия излучения поглощенного фотона прямо пропорциональна частоте и обратно пропорциональна длине волны, что означает, что более короткие длины падающих волн обладают большим квантом энергии.Поглощение фотона энергии флуорофором, которое происходит из-за взаимодействия вектора осциллирующего электрического поля световой волны с зарядами (электронами) в молекуле, является явлением полностью или полностью и может происходить только при падающем свете определенные длины волн, известные как полосы поглощения . Если поглощенный фотон содержит больше энергии, чем необходимо для простого электронного перехода, избыточная энергия обычно преобразуется в колебательную и вращательную энергию.Однако, если происходит столкновение между молекулой и фотоном, энергия которого недостаточна для перехода, поглощения не происходит. Спектрально широкая полоса поглощения возникает из-за близко расположенных уровней колебательной энергии плюс тепловое движение, которое позволяет диапазону энергий фотонов соответствовать конкретному переходу. Поскольку возбуждение молекулы путем поглощения обычно происходит без изменения спаривания электронных спинов, возбужденное состояние также является синглетом. Как правило, флуоресцентные исследования проводятся с использованием излучения с длинами волн от ультрафиолетового до видимого диапазона электромагнитного спектра (от 250 до 700 нанометров).

В ультрафиолетовом или видимом свете обычные флуорофоры обычно возбуждаются до более высоких колебательных уровней первого ( S (1) ) или второго ( S (2) ) синглетного энергетического состояния. Один из переходов поглощения (или возбуждения), представленных на рисунке 1 (левая зеленая стрелка), происходит с самого низкого колебательного уровня энергии основного состояния на более высокий колебательный уровень во втором возбужденном состоянии (переход, обозначенный как S (0 ) = от 0 до S (2) = 3).Второй возбуждающий переход изображен со второго колебательного уровня основного состояния на самый высокий колебательный уровень в первом возбужденном состоянии (обозначен как S (0) = 1 до S (1) = 5). В типичном флуорофоре облучение широким спектром длин волн генерирует целый диапазон разрешенных переходов, которые заселяют различные уровни колебательной энергии возбужденных состояний. Некоторые из этих переходов будут иметь гораздо более высокую степень вероятности, чем другие, и, когда они объединены, составят спектр поглощения молекулы.Обратите внимание, что для большинства флуорофоров спектры поглощения и возбуждения различны, но часто перекрываются и иногда могут стать неразличимыми. В других случаях (например, флуоресцеин) спектры поглощения и возбуждения четко разделены.

Сразу после поглощения фотона произойдет несколько процессов с различной вероятностью, но наиболее вероятной будет релаксация на самый низкий уровень колебательной энергии первого возбужденного состояния ( S (1) = 0; Рисунок 1).Этот процесс известен как внутреннее преобразование , или , колебательная релаксация (потеря энергии в отсутствие излучения света) и обычно происходит за пикосекунду или меньше. Поскольку за время жизни возбужденных состояний происходит значительное количество колебательных циклов, молекулы практически всегда подвергаются полной колебательной релаксации в течение их возбужденных времен жизни. Избыточная колебательная энергия преобразуется в тепло, которое поглощается соседними молекулами растворителя при столкновении с флуорофором в возбужденном состоянии.

Возбужденная молекула существует в наинизшем возбужденном синглетном состоянии ( S (1) ) в течение периодов порядка наносекунд (самый длинный период времени в процессе флуоресценции на несколько порядков), прежде чем окончательно релаксировать в основное состояние. Если релаксация из этого долгоживущего состояния сопровождается испусканием фотона, этот процесс формально известен как флуоресценция. Близко расположенные уровни энергии колебаний основного состояния в сочетании с нормальным тепловым движением создают широкий диапазон энергий фотонов во время излучения.В результате флуоресценция обычно наблюдается как интенсивность излучения в диапазоне длин волн, а не как резкая линия. Большинство флуорофоров могут повторять цикл возбуждения и испускания от многих сотен до тысяч раз до того, как высокореактивная молекула в возбужденном состоянии фотообесцвечивается , что приводит к разрушению флуоресценции. Например, хорошо изученный зонд флуоресцеинизотиоцианат ( FITC ) может подвергаться возбуждению и релаксации в течение примерно 30 000 циклов, прежде чем молекула перестанет реагировать на падающее освещение.

Несколько других путей релаксации с различной степенью вероятности конкурируют с процессом излучения флуоресценции. Энергия возбужденного состояния может рассеиваться без излучения в виде тепла (показано голубой волнистой стрелкой на рисунке 1), возбужденный флуорофор может столкнуться с другой молекулой для передачи энергии во втором типе безызлучательного процесса (например, гашение, как показано фиолетовой волнистой стрелкой на Рисунке 1), или может возникнуть явление, известное как межсистемный переход в самое низкое возбужденное триплетное состояние (синяя волнистая стрелка на Рисунке 1).Последнее событие относительно редко, но в конечном итоге приводит либо к испусканию фотона через фосфоресценцию , либо к переходу обратно в возбужденное синглетное состояние, которое дает задержанную флуоресценцию . Переходы из триплетного возбужденного состояния в синглетное основное состояние являются запрещенными , в результате чего константы скорости триплетного излучения на несколько порядков ниже, чем у флуоресценции.

Оба триплетных перехода между состояниями показаны в правой части энергетического профиля Яблонского, показанного на Рисунке 1.Низкая вероятность межсистемного пересечения возникает из-за того, что молекулы должны сначала пройти спиновое преобразование , чтобы произвести неспаренные электроны, что является неблагоприятным процессом. Первостепенное значение триплетного состояния заключается в высокой степени химической активности, проявляемой молекулами в этом состоянии, что часто приводит к фотообесцвечиванию и образованию повреждающих свободных радикалов. В биологических образцах растворенный кислород является очень эффективным средством тушения флуорофоров в триплетном состоянии.Молекула кислорода в основном состоянии, которая обычно является триплетом, может быть возбуждена до реактивного синглетного состояния, что приводит к реакциям, обесцвечивающим флуорофор или оказывающим фототоксический эффект на живые клетки. Флуорофоры в триплетном состоянии также могут напрямую реагировать с другими биологическими молекулами, что часто приводит к дезактивации обоих видов. Молекулы, содержащие тяжелые атомы, такие как галогены и многие переходные металлы, часто способствуют межсистемному пересечению и часто фосфоресцируют.

Вероятность перехода из основного состояния ( S (0) ) в возбужденное синглетное состояние ( S (1) ) зависит от степени сходства между колебательным и вращательным энергетическими состояниями, когда электрон находится в основное состояние по сравнению с теми, которые присутствуют в возбужденном состоянии, как показано на рисунке 2. Энергетическая диаграмма Франка-Кондона, показанная на рисунке 2, представляет распределение вероятности колебательной энергии между различными уровнями в основном ( S (0) ) и первым возбужденных ( S (1) ) состояний для гипотетической молекулы.Переходы возбуждения (красные линии) из основного в возбужденное состояние происходят за такой короткий промежуток времени (фемтосекунды), что межъядерное расстояние, связанное с связывающими орбиталями, не успевает измениться, и, таким образом, переходы представлены в виде вертикальных линий. Эта концепция упоминается как Принцип Франка-Кондона . Длина волны максимального поглощения (красная линия в центре) представляет собой наиболее вероятное межъядерное разделение в основном состоянии до разрешенного колебательного уровня в возбужденном состоянии.

При комнатной температуре тепловой энергии недостаточно для значительного заселения возбужденных энергетических состояний, и наиболее вероятным состоянием для электрона является основное состояние ( S (O) ), которое содержит ряд различных состояний колебательной энергии, каждое с разными уровни энергии. Наиболее предпочтительными будут переходы, в которых вероятности вращательной и колебательной электронной плотности максимально перекрываются как в основном, так и в возбужденном состояниях (см. Рисунок 2).Однако падающие фотоны с различной длиной волны (и кванты) могут иметь достаточную энергию для поглощения и часто вызывают переходы с других межъядерных расстояний и уровней колебательной энергии. Этот эффект приводит к появлению спектра поглощения, содержащего несколько пиков (рис. 3). Широкий диапазон энергий фотонов, связанный с переходами поглощения флуорофоров, приводит к тому, что результирующие спектры выглядят как широкие полосы, а не дискретные линии.

Гипотетический спектр поглощения, показанный на Рисунке 3 (синяя полоса), является результатом нескольких предпочтительных электронных переходов из основного состояния в самое низкое возбужденное энергетическое состояние (обозначенные S (0) и S (1) , соответственно).На спектр поглощения наложены вертикальные линии (желтые), представляющие переходы от самого низкого колебательного уровня в основном состоянии к более высоким уровням колебательной энергии в возбужденном состоянии. Обратите внимание, что переходы на самые высокие возбужденные колебательные уровни происходят при более высоких энергиях фотонов (более низкая длина волны или большее волновое число). Приблизительные энергии, связанные с переходами, обозначены в электрон-вольтах ( эВ, ) по верхней абсциссе на рисунке 3.Колебательные уровни, связанные с основным и возбужденным состояниями, также включены по правой оси ординат.

Сканирование спектра поглощения флуорофора при регистрации интенсивности излучения на одной длине волны (обычно длина волны максимальной интенсивности излучения) генерирует спектр возбуждения. Аналогичным образом, возбуждение флуорофора на одной длине волны (опять же, предпочтительно на длине волны максимального поглощения) при сканировании по длинам волн излучения покажет профиль спектра излучения.Спектры возбуждения и испускания можно рассматривать как функции распределения вероятности того, что фотон с заданной квантовой энергией будет поглощен и, в конечном итоге, позволит флуорофору испустить второй фотон в форме флуоресцентного излучения.

Стоксов сдвиг и правило зеркального отображения

Если внимательно изучить спектр флуоресцентного излучения флуорофора, сразу становятся очевидными несколько важных особенностей. Спектр излучения не зависит от энергии возбуждения (длины волны) в результате быстрого внутреннего преобразования из более высоких начальных возбужденных состояний в самый низкий уровень колебательной энергии возбужденного состояния S (1) .Для многих распространенных флуорофоров расстояние между уровнями колебательной энергии одинаково для основного и возбужденного состояний, что приводит к спектру флуоресценции, который сильно напоминает зеркальное отображение спектра поглощения. Это связано с тем, что одни и те же переходы наиболее благоприятны как для поглощения, так и для излучения. Наконец, в растворе (где обычно изучаются флуорофоры) детальная колебательная структура обычно теряется, а спектр излучения выглядит как широкая полоса.

Как обсуждалось ранее, после поглощения фотона возбужденный флуорофор быстро релаксирует до самого низкого уровня колебательной энергии возбужденного состояния. Важным следствием этого быстрого внутреннего преобразования является то, что все последующие пути релаксации (флуоресценция, безызлучательная релаксация, межсистемное пересечение и т. Д.) Исходят от низшего колебательного уровня возбужденного состояния ( S (1) ). Как и в случае поглощения, вероятность того, что электрон в возбужденном состоянии вернется на определенный уровень колебательной энергии в основном состоянии, пропорциональна перекрытию уровней энергии в соответствующих состояниях (рис. 2).Обратные переходы в основное состояние ( S (0) ) обычно происходят на более высокий колебательный уровень (см. Рисунок 3), который впоследствии достигает теплового равновесия (колебательная релаксация). Поскольку излучение фотона часто оставляет флуорофор в более высоком колебательном основном состоянии, спектр излучения обычно является зеркальным отображением спектра поглощения, возникающего при переходе из основного состояния в первое возбужденное. Фактически, вероятность возврата электрона на определенный уровень колебательной энергии в основном состоянии аналогична вероятности того, что электрон находился в основном состоянии до возбуждения.Эта концепция, известная как правило зеркального изображения , проиллюстрирована на рисунке 3 для эмиссионных переходов (синие линии) с самого низкого уровня колебательной энергии возбужденного состояния обратно на различные колебательные уровни в основном состоянии. Результирующий спектр излучения (красная полоса) является зеркальным отображением спектра поглощения, отображаемого гипотетическим хромофором.

Во многих случаях возбуждение фотонами высоких энергий приводит к заселению более высоких электронных и колебательных уровней ( S (2) , S (3) и т. Д.)), которые быстро теряют избыточную энергию, когда флуорофор релаксирует до самого нижнего колебательного уровня первого возбужденного состояния (см. рисунок 1). Из-за этого быстрого процесса релаксации спектры излучения обычно не зависят от длины волны возбуждения (некоторые флуорофоры излучают из более высоких энергетических состояний, но такая активность бывает редко). По этой причине излучение является зеркальным отображением переходов от основного состояния к низшим возбужденным состояниям, но не всего спектра поглощения, который может включать переходы на более высокие уровни энергии.Отличной проверкой правила зеркального отображения является исследование спектров поглощения и излучения на линейном графике волнового числа (обратной длины волны или числа волн на сантиметр), которое прямо пропорционально частоте и энергии кванта. При представлении таким образом (см. Рисунок 3) симметрия между коэффициентами экстинкции и интенсивностью спектров возбуждения и испускания как функция отраженных спектров энергетического выхода при наличии взаимных переходов.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения хинина, встречающегося в природе противомалярийного агента (и первого известного флуорофора), флуоресцентные свойства которого были первоначально описаны сэром Джоном Фредериком Уильямом Хершелем в 1845 году.Хинин не придерживается правила зеркального отображения, что становится очевидным при проверке единственного пика в спектре излучения (при 460 нанометрах), который не отражает два пика при 310 и 350 нанометрах, присутствующих в бимодальном спектре поглощения. Более коротковолновый пик поглощения ультрафиолета (310 нанометров) обусловлен переходом возбуждения во второе возбужденное состояние (от S (0) до S (2) ), которое быстро релаксирует в самое низкое возбужденное состояние ( S (1 ) ). Как следствие, испускание флуоресценции происходит исключительно из самого нижнего возбужденного синглетного состояния ( S (1) ), в результате чего получается спектр, который отражает переход основного состояния в первое возбужденное состояние (пик 350 нанометров) в хинине, а не весь спектр поглощения.

Поскольку энергия, связанная с переходами флуоресцентного излучения (см. Рисунки 1-4), обычно меньше энергии поглощения, полученные в результате испускаемые фотоны имеют меньшую энергию и смещены в сторону более длинных волн. Это явление обычно известно как Стоксов сдвиг и наблюдается практически для всех флуорофоров, обычно используемых в исследованиях растворов. Первичная причина стоксова сдвига — это быстрый распад возбужденных электронов на нижний колебательный уровень энергии возбужденного состояния S (1) .Кроме того, флуоресцентное излучение обычно сопровождается переходами на более высокие уровни колебательной энергии основного состояния, что приводит к дальнейшей потере энергии возбуждения для теплового уравновешивания избыточной колебательной энергии. Другие события, такие как эффекты ориентации растворителя, реакции возбужденного состояния, образование комплексов и резонансный перенос энергии, также могут способствовать увеличению длин волн излучения.

На практике стоксов сдвиг измеряется как разность между максимальными длинами волн в спектрах возбуждения и излучения конкретного флуорохрома или флуорофора.Величина сдвига зависит от молекулярной структуры, но может варьироваться от нескольких нанометров до нескольких сотен нанометров. Например, стоксов сдвиг для флуоресцеина составляет примерно 20 нанометров, для хинина — 110 нанометров (см. Рисунок 4), а для порфиринов — более 200 нанометров. Наличие стоксова сдвига имеет решающее значение для чрезвычайно высокой чувствительности измерений флуоресцентной визуализации. Красный сдвиг излучения позволяет использовать прецизионные оптические фильтры с полосой пропускания, чтобы эффективно блокировать попадание возбуждающего света на детектор, поэтому относительно слабый сигнал флуоресценции (имеющий небольшое количество испускаемых фотонов) можно наблюдать на фоне с низким уровнем шума.

Коэффициент экстинкции, квантовый выход и время жизни флуоресценции

Три основных параметра, обычно используемых при описании и сравнении флуорофоров, — это коэффициент экстинкции ( e ), квантовый выход ( F ) и время жизни флуоресценции ( t ). Коэффициенты молярной экстинкции широко используются в областях спектроскопии, микроскопии и флуоресценции для преобразования единиц оптической плотности в единицы молярной концентрации для различных химических веществ.Коэффициент экстинкции определяется путем измерения оптической плотности на эталонной длине волны (характеристика поглощающей молекулы) для одной молярной ( M ) концентрации (один моль на литр) целевого химического вещества в кювете с длиной пути один сантиметр. . Эталонной длиной волны обычно является длина волны максимального поглощения в ультрафиолетовом или видимом спектре света. Коэффициенты экстинкции являются прямой мерой способности флуорофора поглощать свет, и те хромофоры, которые имеют высокий коэффициент экстинкции, также имеют высокую вероятность испускания флуоресценции.Кроме того, поскольку собственное время жизни (обсуждается ниже) флуорофора обратно пропорционально коэффициенту экстинкции, молекулы, демонстрирующие высокий коэффициент экстинкции, имеют возбужденное состояние с коротким собственным временем жизни.

Квантовый выход (иногда неверно обозначаемый как квантовая эффективность ) — это индикатор для измерения эффективности излучения флуоресценции относительно всех возможных путей релаксации и обычно выражается как (безразмерное) отношение испускаемых фотонов к количеству поглощенных фотонов. .Другими словами, квантовый выход представляет собой вероятность того, что данный возбужденный флуорохром произведет испускаемый фотон (флуоресценция). Квантовые выходы обычно находятся в диапазоне от нуля до единицы, а флуоресцентные молекулы, обычно используемые в качестве зондов в микроскопии, имеют квантовые выходы в диапазоне от очень низких (0,05 или меньше) до почти единицы (самые яркие флуорофоры). Как правило, в большинстве приложений получения изображений желателен высокий квантовый выход. Квантовый выход данного флуорофора варьируется, иногда до очень больших значений, в зависимости от факторов окружающей среды, таких как pH, концентрация и полярность растворителя.

Время жизни флуоресценции — это характерное время, в течение которого молекула остается в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние, и является индикатором времени, доступного для сбора информации из профиля излучения. Во время существования возбужденного состояния флуорофор может претерпевать конформационные изменения, а также взаимодействовать с другими молекулами и диффундировать через локальную среду. Спад интенсивности флуоресценции как функция времени в однородной популяции молекул, возбужденных коротким импульсом света, описывается экспоненциальной функцией:

I (т) = I _o e ^{(-т / т)}

, где I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t , I (o) — начальная интенсивность, наблюдаемая сразу после возбуждения, а t — время жизни флуоресценции.Формально время жизни флуоресценции определяется как время, за которое начальная интенсивность флуоресценции флуорофора спадает до 1 / e (приблизительно 37 процентов) от начальной интенсивности (см. Рисунок 5 (а)). Эта величина обратна константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное состояние.

Поскольку уровень флуоресценции прямо пропорционален количеству молекул в возбужденном синглетном состоянии, измерения времени жизни можно проводить, измеряя затухание флуоресценции после короткого импульса возбуждения.В однородном растворителе затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией, как показано на графиках зависимости интенсивности флуоресценции от времени на рисунках 5 (a) и 5 ​​(b). Более сложные системы, такие как жизнеспособные ткани и живые клетки, содержат смешанный набор сред, которые часто дают многоэкспоненциальные значения (рис. 5 (c)) при измерении затухания флуоресценции. Кроме того, некоторые другие процессы могут конкурировать с эмиссией флуоресценции за возврат электронов возбужденного состояния в основное состояние, включая внутреннюю конверсию, фосфоресценцию (межсистемное пересечение) и тушение.Помимо флуоресценции и фосфоресценции, безызлучательные процессы являются основным механизмом, ответственным за релаксацию электронов возбужденного состояния.

Все нефлуоресцентные процессы, которые конкурируют за дезактивацию электронов возбужденного состояния, могут быть удобно объединены в единую константу скорости, называемую константой скорости без излучения и обозначаемую переменной k (nr) . Неизлучательная константа скорости обычно игнорирует любой вклад колебательной релаксации, потому что быстрые скорости (пикосекунды) этих преобразований на несколько порядков выше, чем более медленные переходы дезактивации (наносекунды).Таким образом, квантовый выход теперь можно выразить через константы скорости:

F = испускаемые фотоны / поглощенные фотоны = k _f / (k _f + k _nf ) = t _f / t _o

, где k (f) — константа скорости затухания флуоресценции (символ G также используется для обозначения этой константы скорости). Обратная величина константы скорости распада равна собственному времени жизни ( t (o) ), которое определяется как время жизни возбужденного состояния в отсутствие всех процессов, которые конкурируют за дезактивацию возбужденного состояния.На практике время жизни возбужденного состояния флуоресценции сокращается за счет безызлучательных процессов, что приводит к измеренному времени жизни ( t (f) ), которое является комбинацией собственного времени жизни и конкурирующих нефлуоресцентных механизмов релаксации. Поскольку измеренное время жизни всегда меньше собственного времени жизни, квантовый выход никогда не превышает единицы.

Многие из обычных зондов, используемых в оптической микроскопии, имеют время жизни флуоресценции, измеряемое в наносекундах, но оно может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от молекулярной структуры, растворителя и условий окружающей среды.Количественные измерения времени жизни флуоресценции позволяют исследователям различать флуорофоры, которые имеют схожие спектральные характеристики, но разное время жизни, а также могут дать подсказки для местной окружающей среды. В частности, pH и концентрацию ионов вблизи зонда можно определить, не зная локализованную концентрацию флуорофора, что имеет существенное преимущество при использовании с живыми клетками и тканями, где концентрация зонда может быть неоднородной. Кроме того, измерения срока службы менее чувствительны к артефактам фотообесцвечивания, чем измерения интенсивности.

Закалка и фотообесцвечивание

Последствиями гашения и фотообесцвечивания является эффективное снижение количества излучения, и их следует учитывать в первую очередь при разработке и проведении флуоресцентных исследований. Эти два явления отличаются тем, что тушение часто обратимо, а фотообесцвечивание — нет. Тушение возникает из-за множества конкурирующих процессов, которые вызывают безызлучательную релаксацию (без испускания фотонов) электронов возбужденного состояния до основного состояния, которое может быть внутримолекулярным или межмолекулярным по природе.Поскольку безызлучательные пути перехода конкурируют с релаксацией флуоресценции, они обычно значительно снижают или, в некоторых случаях, полностью устраняют излучение. Большинство процессов гашения действуют, чтобы уменьшить время жизни возбужденного состояния и квантовый выход затронутого флуорофора.

Типичный пример тушения наблюдается при столкновении флуорофора в возбужденном состоянии и другой (нефлуоресцентной) молекулы в растворе, что приводит к дезактивации флуорофора и возвращению в основное состояние.В большинстве случаев ни одна из молекул не изменяется химически в процессе столкновительного тушения. Широкий спектр простых элементов и соединений, включая кислород, галогены, амины и многие органические молекулы с недостатком электронов, ведут себя как тушители со столкновениями . Столкновительное тушение может выявить присутствие локализованных молекул или фрагментов тушителя, которые посредством диффузии или конформационного изменения могут сталкиваться с флуорофором во время жизни возбужденного состояния. Механизмы столкновительного тушения включают перенос электрона, спин-орбитальное взаимодействие и межсистемный переход в возбужденное триплетное состояние.Другие термины, которые часто используются как синонимы к гашению при столкновении, — это внутреннее преобразование и динамическое гашение.

Второй тип механизма тушения, названный статическим или комплексным тушением, возникает из нефлуоресцентных комплексов, образованных между тушителем и флуорофором, которые служат для ограничения поглощения за счет уменьшения популяции активных, возбудимых молекул. Этот эффект возникает, когда флуоресцентные частицы образуют обратимый комплекс с молекулой тушителя в основном состоянии и не зависят от диффузии или молекулярных столкновений.При статическом гашении эмиссия флуоресценции уменьшается без изменения времени жизни возбужденного состояния. Флуорофор в возбужденном состоянии также может быть подавлен дипольным резонансным механизмом передачи энергии, когда он находится в непосредственной близости с молекулой акцептора, которой энергия возбужденного состояния может передаваться без излучения. В некоторых случаях гашение может происходить за счет немолекулярных механизмов, таких как ослабление падающего света поглощающими частицами (включая сам хромофор).

В отличие от гашения, фотообесцвечивание (также называемое исчезновением ) происходит, когда флуорофор навсегда теряет способность к флуоресценции из-за индуцированного фотонами химического повреждения и ковалентной модификации.При переходе из возбужденного синглетного состояния в возбужденное триплетное состояние флуорофоры могут взаимодействовать с другой молекулой с образованием необратимых ковалентных модификаций. Триплетное состояние является относительно долгоживущим по сравнению с синглетным состоянием, что позволяет возбужденным молекулам в течение гораздо более длительного периода времени вступать в химические реакции с компонентами окружающей среды. Среднее количество циклов возбуждения и испускания, которые происходят для конкретного флуорофора перед фотообесцвечиванием, зависит от молекулярной структуры и местной среды.Некоторые флуорофоры быстро обесцвечиваются после излучения всего нескольких фотонов, в то время как другие, более надежные, могут пройти тысячи или миллионы циклов перед обесцвечиванием.

На рисунке 6 представлен типичный пример фотообесцвечивания (выцветания), наблюдаемого в серии цифровых изображений, полученных в различные моменты времени для многократно окрашенной культуры эпителиальных клеток легочной артерии крупного рогатого скота. Ядра окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом ( DAPI ; синяя флуоресценция), а митохондрии и актиновый цитоскелет окрашивали MitoTracker Red (красная флуоресценция) и производным фаллоидина (зеленая флуоресценция) соответственно.Моменты времени снимались с двухминутными интервалами с использованием комбинации флуоресцентных фильтров с полосой пропускания, настроенной для одновременного возбуждения трех флуорофоров, а также регистрации комбинированных сигналов излучения. Обратите внимание, что все три флуорофора имеют относительно высокую интенсивность на рисунке 6 (а), но интенсивность DAPI (синий) начинает быстро падать через две минуты и почти полностью исчезает через шесть минут. Митохондриальные пятна и пятна актина более устойчивы к фотообесцвечиванию, но интенсивность обоих снижается в течение заданной последовательности (10 минут).

Важным классом фотообесцвечивания являются фотодинамические , что означает, что они связаны с взаимодействием флуорофора с комбинацией света и кислорода. Реакции между флуорофором и молекулярным кислородом навсегда разрушают флуоресценцию и приводят к образованию свободных радикалов синглетного кислорода, которые могут химически модифицировать другие молекулы в живых клетках. Степень фотообесцвечивания из-за фотодинамических событий является функцией концентрации молекулярного кислорода и ближайшего расстояния между флуорофором, молекулами кислорода и другими клеточными компонентами.Фотообесцвечивание можно уменьшить, ограничив время воздействия света на флуорофоры или снизив энергию возбуждения. Однако эти методы также уменьшают измеряемый сигнал флуоресценции. Во многих случаях растворы флуорофоров или клеточных суспензий можно дезоксигенировать, но это невозможно для живых клеток и тканей. Возможно, лучшей защитой от фотообесцвечивания является ограничение воздействия на флуорохром интенсивного освещения (с использованием фильтров нейтральной плотности) в сочетании с разумным использованием коммерчески доступных антибликовых реагентов, которые можно добавлять в монтажный раствор или среду для культивирования клеток.

При определенных обстоятельствах эффект фотообесцвечивания также можно использовать для получения конкретной информации, которая иначе была бы недоступна. Например, в экспериментах по восстановлению флуоресценции после фотообесцвечивания ( FRAP ) флуорофоры в целевой области намеренно обесцвечиваются с помощью чрезмерных уровней облучения. Когда новые молекулы флуорофора диффундируют в обесцвеченную область образца (восстановление), интенсивность излучения флуоресценции отслеживается для определения скорости латеральной диффузии целевого флуорофора.Таким образом, трансляционная подвижность флуоресцентно меченных молекул может быть определена в пределах очень небольшой (от 2 до 5 микрометров) области отдельной клетки или участка живой ткани.

Влияние растворителя на излучение флуоресценции

На испускание флуоресценции влияют различные факторы окружающей среды, включая взаимодействия между флуорофором и окружающими молекулами растворителя (обусловленные полярностью растворителя), другими растворенными неорганическими и органическими соединениями, температурой, pH и локальной концентрацией флуоресцентных частиц.Влияние этих параметров широко варьируется от одного флуорофора к другому, но спектры поглощения и излучения, а также квантовые выходы могут сильно зависеть от переменных окружающей среды. Фактически, высокая степень чувствительности флуоресценции в первую очередь связана с взаимодействиями, которые происходят в локальной среде во время существования возбужденного состояния. Флуорофор можно рассматривать как совершенно другую молекулу в возбужденном состоянии (чем в основном состоянии), и, таким образом, он будет демонстрировать альтернативный набор свойств в отношении взаимодействия с окружающей средой в возбужденном состоянии по сравнению с основным состоянием.

В растворе молекулы растворителя, окружающие флуорофор в основном состоянии, также имеют дипольные моменты, которые могут взаимодействовать с дипольным моментом флуорофора, давая упорядоченное распределение молекул растворителя вокруг флуорофора. Разница уровней энергии между основным и возбужденным состояниями флуорофора вызывает изменение дипольного момента молекулы, что в конечном итоге вызывает перестройку окружающих молекул растворителя. Однако принцип Франка-Кондона гласит, что при возбуждении флуорофора молекула возбуждается до более высокого уровня электронной энергии за гораздо более короткий промежуток времени, чем требуется молекулам флуорофора и растворителя для переориентации в растворе растворителя. интерактивная среда.В результате возникает временная задержка между событием возбуждения и переупорядочением молекул растворителя вокруг сольватированного флуорофора (как показано на рисунке 7), который обычно имеет гораздо больший дипольный момент в возбужденном состоянии, чем в основном состоянии. .

После того, как флуорофор был возбужден до более высоких колебательных уровней первого возбужденного синглетного состояния ( S (1) ), избыточная колебательная энергия быстро теряется в окружающих молекулах растворителя, поскольку флуорофор медленно релаксирует до самого низкого уровня колебательной энергии (происходит в пикосекундная шкала времени).Молекулы растворителя способствуют стабилизации и дальнейшему снижению уровня энергии возбужденного состояния за счет переориентации (называемой релаксацией растворителя ) вокруг возбужденного флуорофора в более медленном процессе, который требует от 10 до 100 пикосекунд. Это имеет эффект уменьшения энергетического разделения между основным и возбужденным состояниями, что приводит к красному смещению (в сторону более длинных волн) флуоресцентного излучения. Увеличение полярности растворителя приводит к соответственно большему снижению уровня энергии возбужденного состояния, в то время как уменьшение полярности растворителя снижает влияние растворителя на уровень энергии возбужденного состояния.Полярность флуорофора также определяет чувствительность возбужденного состояния к действию растворителя. Полярные и заряженные флуорофоры проявляют гораздо более сильный эффект, чем неполярные флуорофоры.

Эффекты релаксации растворителя на флуоресценцию могут резко повлиять на величину стоксовых сдвигов. Например, гетероциклический индольный фрагмент аминокислоты триптофана обычно находится в гидрофобной внутренней части белков, где относительная полярность окружающей среды низкая.При денатурации типичного белка-хозяина с помощью тепла или химического агента окружающая среда остатка триптофана изменяется с неполярной на высокополярную, поскольку индольное кольцо выходит в окружающий водный раствор. Длина волны флуоресцентного излучения увеличивается примерно с 330 до 365 нанометров, сдвиг на 35 нанометров из-за эффектов растворителя. Таким образом, спектры излучения как собственных, так и внешних флуоресцентных зондов можно использовать для исследования эффектов полярности растворителя, молекулярных ассоциаций и образования комплексов с полярными и неполярными небольшими молекулами и макромолекулами.

Следует постоянно контролировать количественные исследования флуоресценции для выявления потенциальных сдвигов в профилях эмиссии, даже если они не предназначены и не ожидаются. В простых системах, в которых можно установить однородную концентрацию, следует наблюдать постепенное увеличение интенсивности излучения как функцию увеличения концентрации флуорофора, и наоборот. Однако в сложных биологических системах концентрация флуоресцентного зонда может изменяться локально в широком диапазоне, а флуктуации интенсивности или спектральные сдвиги часто являются результатом изменений pH, концентрации ионов кальция, передачи энергии или присутствия гасящего агента, а не флуорофора. стехиометрия.При оценке результатов экспериментальных процедур всегда следует учитывать возможность неожиданного воздействия растворителя или других воздействий окружающей среды.

Анизотропия флуоресценции

Флуоресцентное излучение от большого количества образцов становится поляризованным, когда собственные или внешние флуорофоры возбуждаются плоскополяризованным светом. Уровень поляризованного излучения описывается в терминах анизотропии, и образцы, которые демонстрируют некоторую степень анизотропии, также демонстрируют обнаруживаемый уровень поляризованного излучения.Наблюдение и измерение анизотропии флуоресценции основаны на фотоселективном возбуждении флуорофоров за счет временного совмещения дипольного момента поглощения с ориентированным вектором электрического поля освещающих фотонов (поляризованный свет). Когда флуорофор поглощает падающий фотон, событие возбуждения возникает из-за взаимодействия между осциллирующей составляющей электрического поля входящего излучения и дипольным моментом перехода, создаваемым электронным состоянием молекулярных орбиталей флуорофора.Флуорофоры предпочтительно поглощают те фотоны, вектор электрического поля которых параллелен дипольному моменту перехода поглощения флуорофора.

Флуоресцентное излучение также происходит в плоскости, определяемой направлением дипольного момента перехода излучения. Каждый флуорофор фиксирует в своей молекулярной структуре дипольный момент перехода поглощения и испускания (рис. 8), которые имеют определенную ориентацию относительно молекулярных осей молекулы красителя и отделены друг от друга углом ( q ).На рисунке 8 представлен гипотетический трехъядерный ароматический гетероциклический флуорофор (расположенный аналогично системе акридиновых колец), на который нанесены стрелки, представляющие пространственное соотношение векторов дипольного момента перехода поглощения (желтая стрелка) и испускания (красная стрелка). Во время жизни возбужденного состояния ( t ) вращение флуорофора деполяризует его излучение относительно вектора возбуждения, что приводит к механизму измерения жесткости среды, содержащей флуорофор.

Освещение изотропного раствора, содержащего беспорядочно ориентированные флуорофоры, с помощью плоскополяризованного света предпочтительно будет возбуждать только те молекулы, дипольные моменты перехода поглощения которых расположены параллельно (или почти так) плоскости электрического вектора поляризации. Вероятность поглощения фактически пропорциональна квадрату косинуса угла между диполем и вектором электрического поля падающего света (поглощение является максимальным, когда угол равен нулю градусов, и достигает минимума, когда угол приближается к 90 градусам).Результатом будет особый процесс фотоселекции субпопуляции возбужденных флуорофоров из исходного ансамбля, в результате чего будут получены флуорофоры в возбужденном состоянии, ориентированные параллельно определенной оси. Флуоресцентное излучение этой субпопуляции также будет частично поляризованным. Измерения относительного угла между дипольными моментами переходов возбуждения и излучения определяют степень поляризации ( p ) или анизотропии ( r ), как определяется уравнениями:

p = (I — I ) / (I + I ) и r = (I — I ) / (I + 2I )

, где I () — эмиссия флуоресценции, измеренная в плоскости, параллельной плоскости возбуждения, а I () — эмиссия флуоресценции, измеренная в плоскости, перпендикулярной плоскости возбуждения.На практике количество поляризованного света рассчитывается путем измерения излучения, собираемого с помощью поляризатора, размещенного на пути света возбуждения, и анализатора, размещенного на пути излучения света, который ориентирован либо параллельно, либо перпендикулярно поляризатору возбуждения (см. Рисунок 9). И анизотропия, и поляризация являются выражениями одного и того же явления, и значения можно легко преобразовать друг в друга. В большинстве случаев выражение анизотропии предпочтительнее, потому что соответствующие математические уравнения проще, если выразить через этот параметр.

Поскольку дипольный момент эмиссионного перехода смещен от момента возбуждения из-за пространственной ориентации (см. Рисунок 8), некоторая степень деполяризации будет иметь место, даже если флуорофоры зафиксированы на месте. Таким образом, сам процесс поглощения является первым источником деполяризации флуоресценции. Вращательное движение флуорофора, которое неизменно происходит в течение времени жизни возбужденного состояния, приводит к дополнительному смещению диполя эмиссионного перехода от исходной ориентации и дополнительно снижает наблюдаемую анизотропию эмиссии.Скорость вращения зависит как от размера флуорофора (или макромолекулы, с которой он связан), так и от вязкости его локализованного окружения. Анизотропия флуоресценции раствора может быть связана с вращательной подвижностью флуорофора уравнением Перрина:

r ₀ / r = 1 + (RTt) / (hV)

, где r (0) — предельная анизотропия (анизотропия, наблюдаемая в отсутствие вращения флуорофора), r — измеренная анизотропия, ч, — вязкость окружающей среды, V — объем вращающейся молекулы, R — универсальная газовая постоянная, T — температура раствора по шкале Кельвина и t — время жизни возбужденного состояния флуорофора.На практике уравнение Перрина сокращается, чтобы выразить зависящее от времени затухание анизотропии через время корреляции вращения ( f ) флуорофора:

r ₀ / r = 1 + t / f , где f = (hV) / (RT)

Среди явлений, которые приводят к (более низким) измеренным значениям анизотропии флуоресценции, отклоняющимся от максимального теоретического предела, является естественная вращательная диффузия молекул, которая происходит в течение жизни возбужденного состояния.В растворе флуорофоры с малой молекулярной массой (до нескольких тысяч дальтон) имеют время корреляции вращения в диапазоне от 50 до 100 пикосекунд, что значительно выше скорости излучения и смещает или случайным образом распределяет дипольный момент перехода излучения. Поскольку среднее время жизни в возбужденном состоянии типичного флуорофора находится в наносекундном диапазоне, молекулы могут вращаться много раз перед испусканием. В результате поляризованное излучение рандомизируется, так что суммарная анизотропия равна нулю.Второй (но гораздо более редкий) механизм обычно наблюдаемого уменьшения анизотропии — это передача энергии возбуждения между флуорофорами.

Ассоциация флуорофора с гораздо большей макромолекулой приводит к резкому увеличению времени корреляции вращения. В большинстве случаев время корреляции для большого белка в растворе составляет от 10 до 50 наносекунд, что равно или превышает среднее время жизни в возбужденном состоянии типичного флуорофора. Связывание флуорофора замедляет вращательное движение флуоресцентного зонда и позволяет исследовать время корреляции вращения белка-хозяина.Более мелкие белки обычно показывают гораздо более короткое время корреляции, чем более крупные белки или белки, участвующие в сложных биологических ансамблях, и можно ожидать, что они будут вызывать более низкую анизотропию.

Инструментальный подход для измерения поляризации флуоресценции с помощью оптического микроскопа представлен на рисунке 9. Плоскополяризованный возбуждающий свет генерируется путем прохождения света от осветителя дугового разряда через линейный поляризатор. Плоскополяризованный возбуждающий свет максимально поглощается флуорофорами в образце (на предметном стекле микроскопа), дипольные моменты поглощения которых ориентированы параллельно плоскости возбуждающего света.Это приводит к возбуждению определенной субпопуляции флуорофоров (анизотропный набор флуорофоров). Теоретически все возбужденные флуорофоры обладают одинаковой ориентацией дипольных моментов поглощения и излучения. Флуоресценция, испускаемая впоследствии флуорофором, измеряется как в параллельной, так и в перпендикулярной ориентации по отношению к плоскости поляризации возбуждающего освещения. По мере того как флуорофор вращается в течение своего возбужденного состояния, уровень излучения, наблюдаемого параллельно плоскости возбуждения, будет непрерывно уменьшаться, в то время как количество излучения, регистрируемого перпендикулярно плоскости возбуждения, будет одновременно увеличиваться.

Как обсуждалось выше, измерения анизотропии флуоресценции могут предоставить информацию о вращательной подвижности белков, из которой можно сделать вывод об их молекулярной массе и форме. Кроме того, можно отслеживать межмолекулярные ассоциации, а также конформационные изменения и денатурацию белка. Этот метод также использовался для исследования внутренней гибкости белков и ряда физических свойств биологических мембран, включая вязкость, фазовые переходы, химический состав и влияние возмущения мембраны на эти свойства.Измерения анизотропии флуоресценции могут быть выполнены в установившихся системах с использованием непрерывного освещения или в экспериментах с временным разрешением, в которых используются события импульсного возбуждения.

Резонансная передача энергии

Флуорофор в возбужденном состоянии может, как обсуждалось выше, терять энергию возбуждения, преобразовывая ее в свет (флуоресценция), посредством теплового равновесия (колебательная релаксация) или путем передачи другой молекуле через столкновение или образование комплекса (безызлучательная диссипация и закалка).При образовании комплекса или столкновении с молекулой растворителя энергия передается за счет взаимодействия электронных орбиталей между флуорофором и второй молекулой. Существует также еще один процесс, называемый резонансной передачей энергии ( RET ), посредством которого флуорофор в возбужденном состоянии (называемый донором ) может передавать свою энергию возбуждения соседнему хромофору (акцептор ) безызлучательно. через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях на расстояниях, измеряемых в нанометрах.Основная теория резонансной передачи энергии предполагает, что донорный флуорофор можно рассматривать как осциллирующий диполь , который может передавать энергию подобному диполю на определенной резонансной частоте аналогично поведению связанных осцилляторов, например, пара настраиваемых вилки вибрируют с одинаковой частотой.

Резонансная передача энергии потенциально возможна, когда спектр излучения донорного флуорофора перекрывает спектр поглощения акцептора, который сам по себе не обязательно является флуоресцентным.Важная концепция для понимания этого механизма передачи энергии состоит в том, что процесс не включает испускание света от донора с последующим поглощением испускаемых фотонов акцептором. Другими словами, в механизме резонансной передачи энергии нет промежуточного фотона. Передача энергии проявляется как в тушении эмиссии донорной флуоресценции в присутствии акцептора, так и в увеличении ( сенсибилизированных ) эмиссии акцепторной флуоресценции.

На рисунке 10 показаны изменения интенсивности излучения спектральных профилей от связанных молекул донора и акцептора, претерпевающих резонансную передачу энергии. Перекрытие (серая область) между спектрами излучения донора (центральная серая кривая) и спектрами поглощения акцептора (центральная желтая кривая) необходимо для того, чтобы процесс происходил. Когда это перекрытие присутствует, и донор и акцептор разделены менее чем на 10 нанометров, энергия возбуждения донора может передаваться акцептору без излучения.Конечный результат — гашение флуоресценции донора (красная кривая) и увеличение интенсивности излучения акцептора (сенсибилизированная эмиссия, красная пунктирная кривая). Отдельные спектральные профили для донора и акцептора на рисунке 10 можно идентифицировать, используя легенду в верхнем левом углу рисунка.

Эффективность резонансной передачи энергии изменяется в зависимости от степени спектрального перекрытия, но, что наиболее важно, как величина, обратная шестой степени расстояния (радиус, r ), разделяющего донорные и акцепторные хромофоры.Передача энергии акцептору требует, чтобы расстояние между хромофорами было относительно небольшим, в пределах от 1 до 10 нанометров. Это явление может быть обнаружено путем возбуждения меченого образца с длинами волн освещения, соответствующими максимуму поглощения (возбуждения) донора, и детектирования флуоресцентного излучения в области пикового излучения акцептора. В качестве альтернативы время жизни флуоресценции донора можно измерить в присутствии и в отсутствие акцептора.Зависимость эффективности передачи энергии от расстояния между донором и акцептором обеспечивает основу для использования резонансной передачи энергии в изучении биологии клетки. Этот аспект резонансной передачи энергии позволяет использовать метод в качестве спектроскопической линейки для изучения и количественной оценки взаимодействий между клеточными компонентами, а также конформационных изменений внутри отдельных макромолекул на молекулярном уровне.

Для возникновения резонансной передачи энергии должен быть установлен набор особых условий.Донорный хромофор должен обладать способностью к флуоресценции с разумным квантовым выходом в сочетании с достаточно большим временем жизни, а расстояние между донорными и акцепторными молекулами должно быть относительно небольшим (в большинстве случаев всего пара нанометров). Кроме того, как обсуждалось выше, план исследований резонансного переноса энергии не включает рассмотрение фактического поглощения света акцептором. Скорость передачи энергии ( K (T) ) и эффективность передачи энергии ( E (T) ) связаны со временем жизни донора в присутствии или в отсутствие акцептора.Константа скорости передачи энергии выражается как:

K _T = (1 / т _D ) (R ₀ / r) ⁶

, где R (0) — критическое расстояние Ферстера , которое представляет собой радиус разделения донора и акцептора, при котором вероятность передачи энергии равна скорости девозбуждения (распада) донора в отсутствие акцептора. Таким образом, расстояние Ферстера, обычно составляющее от 2 до 7 нанометров для большинства измерений резонансной передачи энергии, представляет собой расстояние между хромофорами, при котором передача энергии эффективна на 50 процентов.Также в уравнении t (D) — это переменная, используемая для обозначения времени жизни донора в отсутствие акцептора, а r — это расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Изучая уравнение, становится ясно, что скорость резонансной передачи энергии равна скорости распада донора (обратная времени жизни) в отсутствие акцептора, когда радиус между хромофорами равен расстоянию Ферстера. В этот момент эффективность переноса составляет 50 процентов, а эмиссия донора будет уменьшена до половины нормальной интенсивности в отсутствие акцептора.Поскольку скорость передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени разделительного расстояния, близость между донором и акцептором явно является доминирующим термином. Критическое расстояние Ферстера, выраженное в нанометрах, рассчитывается по формуле:

R ₀ = 2,11 x 10 ^-2 [ч ^-4 Q ₀ k ² Дж (л)] ^1/6

Уравнение расстояния Ферстера вводит понятие k ² ( k-квадрат ), который представляет собой коэффициент ориентации , описывающий пространственные отношения между донорными и акцепторными диполями поглощения и излучения в трехмерном пространстве.Если дипольная ориентация между двумя хромофорами случайна (из-за быстрого вращения донорной и акцепторной молекул), коэффициент ориентации принимается равным среднему статистическому значению (значение 2/3 или 0,67) для большинства расчетов R (0 ) . Показатель преломления среды, в которой происходит перенос энергии, обозначается переменной h , а Q (0) — квантовый выход донора в отсутствие акцептора. Интеграл перекрытия, J (l) , определяет область перекрытия между спектрами излучения донора и спектром поглощения акцептора (показано серой заштрихованной областью на рисунке 10).Эффективность передачи энергии ( E (T) ) связана с расстоянием между донором и акцептором ( r ) уравнением:

r = R ₀ [(1 / E _T ) — 1] ^1/6 , где E _T = 1 — (t _DA / t _D )

Таким образом, измеряя время жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора ( t (DA) ) и без акцептора ( t (D) ), можно определить эффективность передачи энергии и расстояние, разделяющее два хромофора. определяется.Поскольку на эффективность резонансной передачи энергии в значительной степени влияет диффузия донора и акцептора в течение срока службы донора, измерения с временным разрешением являются наиболее подходящими для анализа пространственно флуктуирующих систем. Эффективность переноса также можно измерить с помощью методов стационарного состояния с использованием относительной интенсивности излучения флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Однако эти расчеты ограничены ситуациями, когда донор и акцептор разделены фиксированным расстоянием, например, когда оба хромофора связаны с одной и той же макромолекулой.Это не относится к донорам и акцепторам, связанным с разными белками или белком и нуклеиновой кислотой, где часто требуется информация с временным разрешением. Аналогичным образом, для смеси хромофоров в растворе или случайным образом распределенных по мембранам необходимы более сложные вычисления, которые принимают во внимание среднюю скорость переноса пространственно распределенных молекул.

Исследования резонансного переноса энергии предоставляют уникальную информацию по сравнению с данными, полученными в результате альтернативных экспериментов, включающих анизотропию флуоресценции, релаксацию растворителя, гашение или реакции в большинстве возбужденных состояний.Большинство количественных измерений флуоресценции основаны на короткодействующих взаимодействиях между флуорофором и другими молекулами в непосредственной близости, включая окружающие молекулы растворителя. Напротив, эффекты растворителя и даже присутствие большой макромолекулы (такой как белок или нуклеиновая кислота) мало влияют на эффективность передачи энергии между донором и акцептором. Основным фактором, который следует учитывать при измерении резонансной передачи энергии, в отличие от других методов, является фактическое физическое расстояние между молекулами донора и акцептора.

Выводы

Даже несмотря на то, что явление флуоресценции кажется почти мгновенным, с нынешними приборами относительно длительный промежуток времени между поглощением фотона и испусканием второго фотона флуорофором открывает двери для значительного числа исследований с использованием этой замечательной методологии. В палитру методов флуоресценции входят наблюдаемые изменения в спектрах поглощения и излучения, квантовом выходе, времени жизни, тушении, фотообесцвечивании, анизотропии, передаче энергии, эффектах растворителя, диффузии, комплексообразовании и множестве переменных окружающей среды.Все эти факторы могут быть легко оценены путем интерпретации спектральных свойств собственных и внешних флуорофоров в устойчивом состоянии или с временным разрешением.

В сочетании с оптическим микроскопом флуоресценция позволяет исследователям изучать широкий спектр явлений в клеточной биологии. Прежде всего, это анализ внутриклеточного распределения конкретных макромолекул в субклеточных ансамблях, таких как ядро, мембраны, цитоскелетные филаменты, митохондрии, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум.В дополнение к постоянным наблюдениям за клеточной анатомией, флуоресценция также полезна для исследования внутриклеточной динамики и взаимодействий между различными макромолекулами, включая диффузию, константы связывания, скорости ферментативных реакций и различные механизмы реакции, в измерениях с временным разрешением. Другие важные процессы также являются объектами исследования с использованием высокой степени специфичности и пространственного разрешения, доступной при флуоресцентной микроскопии. Например, флуоресцентные зонды использовались для мониторинга внутриклеточного pH и локальной концентрации важных ионов, а также для изучения жизнеспособности клеток и факторов, влияющих на скорость апоптоза.Точно так же важные клеточные функции, такие как эндоцитоз, экзоцитоз, передача сигнала и генерация трансмембранного потенциала, стали предметом изучения с помощью флуоресцентной микроскопии. При рассмотрении большого количества приложений, в которых используется флуоресцентный анализ, становится очевидным, почему значительная полезность флуоресцентной микроскопии вывела этот метод на передний план биомедицинских исследований.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Дуглас Б. Мерфи — Отделение клеточной биологии и анатомии и установка микроскопов, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса, 725 N.Wolfe Street, 107 WBSB, Балтимор, Мэриленд 21205.

Кеннет Р. Спринг — научный консультант, Ласби, Мэриленд, 20657.

Майкл У. Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 г. Восток Пол Дирак, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

---

НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ВВЕДЕНИЕ

НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.

© 1998-2019, автор — Майкл В. Дэвидсон и Государственный университет Флориды. Все права защищены. Никакие изображения, графика, сценарии или апплеты не могут быть воспроизведены или использованы каким-либо образом без разрешения владельцев авторских прав. Использование этого веб-сайта означает, что вы соглашаетесь со всеми юридическими положениями и условиями, изложенными владельцами.

Этот веб-сайт поддерживается нашей командой
по графике и веб-программированию
в сотрудничестве с оптической микроскопией в Национальной лаборатории сильного магнитного поля
.

Последнее изменение: пятница, 13 ноября 2015 г., 13:19

Счетчик доступа с 30 мая 2003 г .: 266576

Для получения дополнительной информации о производителях микроскопов,
используйте кнопки ниже для перехода на их веб-сайты:

Праймер для микроскопии молекулярных выражений

: свет и цвет — флуоресценция

Флуоресценция

Обзор основ возбуждения и излучения

Из-за своей новой электронной конфигурации флуорохромы имеют уникальные и характерные спектры поглощения (обычно подобные возбуждению) и излучения.Эти спектры поглощения и излучения показывают относительную интенсивность флуоресценции , причем относительная интенсивность, классически нанесенная на вертикальной оси, в зависимости от длины волны на горизонтальной оси. Для данного флуорохрома производители указывают длину волны для пика интенсивности возбуждения освещения и длину волны для пика интенсивности излучения флуоресценции. Важно понимать происхождение графиков и кривых, отображающих спектры возбуждения и излучения для данного флуорохрома.

Чтобы определить спектр излучения конкретного флуорохрома, определяют длину волны максимального поглощения (обычно такую ​​же, как максимум возбуждения), и флуорохром возбуждается на этой длине волны. Спектр поглощения типичного флуорохрома показан на рисунке 1 (а), где относительная интенсивность поглощения отложена в зависимости от измеренной длины волны. Затем используется монохроматор (устройство, которое позволяет пропускать узкие полосы длин волн света) для сканирования интенсивности излучения флуоресценции по всей серии длин волн излучения.Относительная интенсивность флуоресценции измеряется на различных длинах волн для построения спектра излучения, как показано на рисунке 1 (b). Спектр возбуждения данного флуорохрома определяется аналогичным образом путем мониторинга излучения флуоресценции на длине волны максимальной интенсивности, в то время как флуорофор возбуждается через группу последовательных длин волн. Выбирается максимум излучения, и только свету излучения с этой длиной волны разрешается проходить к детектору.Возбуждение индуцируется (обычно с помощью монохроматора) на различных длинах волн возбуждения, и интенсивность испускаемой флуоресценции измеряется как функция длины волны. Результатом является график или кривая (проиллюстрированная на Фигуре 1 (а)), которая отображает относительную интенсивность флуоресценции , создаваемую возбуждением, в спектре длин волн возбуждения.

	Интерактивное учебное пособие

Несколько наблюдений можно сделать с помощью типичного набора кривых или спектров возбуждения и излучения.Обычно имеет место перекрытие между концом с более высокой длиной волны спектра возбуждения и концом с более низкой длиной волны спектра излучения. Это перекрытие интенсивностей и длин волн возбуждения и испускания (проиллюстрировано на рисунке 1 (c)) должно быть устранено во флуоресцентной микроскопии посредством соответствующего выбора фильтра возбуждения, дихроматического светоделителя (при флуоресценции отраженного света) и барьера или излучения. фильтр. В противном случае гораздо более яркий возбуждающий свет подавляет более слабый излучаемый флуоресцентный свет и значительно снижает контраст образца.

Когда электроны переходят из возбужденного состояния в основное состояние (см. Ниже раздел, озаглавленный Молекулярное объяснение ), происходит потеря колебательной энергии. В результате спектр излучения смещается в сторону более длинных волн, чем спектр возбуждения (длина волны изменяется обратно пропорционально энергии излучения). Это явление известно как закон Стокса или сдвиг Стокса . Чем больше стоксов сдвиг, тем легче отделить возбуждающий свет от испускаемого.Пик интенсивности излучения обычно ниже, чем пик возбуждения, а кривая излучения часто является зеркальным отображением кривой возбуждения, но смещенной в сторону более длинных волн. Чтобы достичь максимальной интенсивности флуоресценции, флуорохром обычно возбуждают на длине волны на пике кривой возбуждения, а детектирование излучения выбирают на длине волны пика (или других длинах волн, выбранных наблюдателем) кривой излучения. Выбор длин волн возбуждения и эмиссии контролируется соответствующими фильтрами.При определении спектрального отклика оптической системы требуются технические поправки, чтобы учесть такие факторы, как пропускание через стекло и переменные чувствительности детектора для разных длин волн.

Типичная спектральная диаграмма поглощения-излучения флуорохрома проиллюстрирована на рисунке 2. Обратите внимание, что кривые интенсивности флуоресценции для поглощения (обычно подобные кривой возбуждения для чистых соединений) и излучения для этого типичного флуорохрома имеют несколько схожую форму.Сдвиг длины волны между возбуждением и излучением известен с середины девятнадцатого века (закон Стокса). Также обратите внимание, что кривые возбуждения и излучения в некоторой степени перекрываются на верхнем конце возбуждения и на более низких длинах волн кривой излучения.

	Интерактивное учебное пособие

Разделение длин волн возбуждения и излучения достигается за счет правильного выбора фильтров для блокировки или пропускания определенных длин волн спектра, как показано на рисунке 3.Конструкция флуоресцентных осветителей основана на управлении возбуждающим светом и испускаемым светом с помощью легко заменяемых фильтров, вставляемых в световой путь на пути к образцу, а затем исходящий от образца. Ввиду низкой интенсивности излучения важно, чтобы выбранный для возбуждения источник света имел достаточную яркость, чтобы можно было максимизировать относительно слабый свет излучения, и чтобы были выбраны флуорохромы с удовлетворительным поглощением и выходом.

Эффективность, с которой флуорохром поглощает возбуждающий свет, известна как коэффициент экстинкции.Чем больше коэффициент экстинкции, тем больше вероятность поглощения света в данной области длин волн (необходимое условие для последующего излучения флуоресценции). Выход излучаемого света называется квантовым выходом, отношением количества излучаемых квантов («пакетов» энергии) к количеству поглощенных квантов (обычно выход составляет от 0,1 до 0,9). Квантовые выходы ниже 1 являются результатом потери энергии из-за безызлучательных путей (таких как тепло или фотохимическая реакция), а не из-за повторного излучения флуоресценции.Ниже в таблице 1 приведены квантовые выходы флуоресценции для группы выбранных флуорохромов. Обратите внимание, что некоторые квантовые выходы кажутся незначительными (бензол), в то время как другие очень эффективными (флуоресцеин и родамин-B).

Квантовый выход флуоресценции флуорохромов

Соединение Растворитель Возбуждение Длина волны (нм) Излучение Длина волны (нм) Quantum Yield Акридиновый апельсин Этанол 493 535 0.46 Бензол Этанол 248 300-350 0,04 Хлорофилл-A Этанол 440 685 0,23 Эозин Вода 521 544 0.16 Флуоресцеин Вода 437 515 0,92 Родамин-В Этанол 555 627 0,97

Таблица 1

Коэффициент экстинкции, квантовый выход, средняя сила света источника света и время жизни флуоресценции — все это важные факторы, влияющие на интенсивность и полезность флуоресцентного излучения.Кроме того, локализованная среда, окружающая флуорохром, играет первостепенную роль в определении характеристик излучения флуоресценции. Такие переменные, как вязкость растворителя, концентрация ионов, pH и гидрофобность в окружающей среде, могут иметь сильное влияние как на интенсивность флуоресценции, так и на время жизни возбужденного состояния.

Молекулярное объяснение флуоресценции

Активность флуоресценции

иногда изображают схематически, как показано на Рисунке 4 (а) (называемой энергетической диаграммой Яблонски ).До возбуждения электронная конфигурация молекулы описывается как находящаяся в основном состоянии. При поглощении фотона возбуждающего света, обычно коротковолнового, электроны могут быть подняты до более высокого энергетического и колебательного возбужденного состояния, процесс, который может занять всего квадриллионную долю секунды (период времени, обычно называемый фемтосекундами, 10E- 15 секунд).

При флуоресценции в течение интервала приблизительно триллионной секунды (пикосекунды или 10E-12 секунд) возбужденные электроны могут потерять некоторую колебательную энергию в окружающую среду и вернуться в то, что называется наинизшим возбужденным синглетным состоянием.Из самого нижнего возбужденного синглетного состояния электроны затем могут «релаксировать» обратно в основное состояние с одновременным испусканием флуоресцентного света, как показано на рисунке 4 (а). Излучаемый свет всегда имеет большую длину волны, чем свет возбуждения (закон Стокса), и продолжается до тех пор, пока возбуждающее освещение омывает флуоресцентный образец. Если возбуждающее излучение прекращается, флуоресценция прекращается.

	Интерактивное учебное пособие

Иногда возбужденные электроны вместо релаксации в низшее синглетное состояние посредством колебательного взаимодействия совершают запрещенный переход в возбужденное триплетное состояние, а затем в основное состояние в процессе, при котором испускание излучения может быть значительно задержано до нескольких секунд. или больше.Это явление характерно для фосфоресценции, как показано на рисунке 4 (б). В некоторых случаях возбужденные электроны могут переходить из триплетного состояния обратно в самое низкое возбужденное синглетное состояние, а затем возвращаться в основное состояние, впоследствии испуская флуоресцентный свет. Это действие занимает немного больше времени (около микросекунды или две), чем обычная флуоресценция, и называется замедленной флуоресценцией (рисунок 4 (c)). При других обстоятельствах (например, фотообесцвечивание или присутствие солей тяжелых металлов или других химикатов) излучаемый свет может быть значительно уменьшен или полностью остановлен, как обсуждается ниже.

Выцветание или фотообесцвечивание

Существуют определенные условия, которые могут повлиять на повторное излучение света возбужденным флуорофором и, таким образом, снизить интенсивность флуоресценции. Это снижение интенсивности излучения обычно называется затуханием или фотообесцвечиванием . Некоторые авторы далее подразделяют выцветание на тушение и обесцвечивание. Отбеливание — это необратимое разложение флуоресцентных молекул из-за интенсивности света в присутствии молекулярного кислорода.Тушение также приводит к снижению интенсивности флуоресценции и часто происходит в результате действия окислителей или присутствия солей тяжелых металлов или галогенных соединений.

Часто гашение происходит в результате передачи энергии другим молекулам акцептора, физически близким к возбужденным флуорофорам, явление, известное как резонансный перенос энергии. Это конкретное явление стало основой для новой техники измерения расстояний, намного меньших поперечного разрешения светового микроскопа.

Обесцвечивание привело к появлению метода, известного как FRAP , или восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания. FRAP основан на отбеливании короткими импульсами лазера и последующем наблюдении восстановления флуоресценции, вызванного диффузией флуорофоров в обесцвеченную область.

Свойства популярных антифадных реагентов

Реагент антифад Комментарии п-фенилен- диамин Самый эффективный реагент для FITC.Также эффективен для родамина. Для использования следует довести до 0,1% п-фенилендиамина в глицерине / PBS. Реагент чернеет под воздействием света, поэтому его следует хранить в темном месте. Контакт с кожей чрезвычайно опасен. DABCO (1,4-диазаби- цикло-2,2,2- октан) Высокоэффективен для FITC. Хотя его действие немного ниже, чем у п-фенилендиамина, он более устойчив к свету и отличается более высоким уровнем безопасности. н-пропилгаллат Самый эффективный реагент для родамина, также эффективен для FITC. Для использования необходимо довести до 1% пропилгаллата в глицерине / PBS. 2-меркапто- этиламин Используется для исследования образцов хромосом и ДНК, окрашенных йодидом пропидия, акридиновым оранжевым или хромомизином A3. Необходимо довести до 0,1 мМ 2-меркаптотейламина в Трис-ЭДТА

Таблица 2

Чтобы уменьшить степень выцветания некоторых образцов, может быть целесообразно использовать фильтр нейтральной плотности на пути света до того, как освещение достигнет фильтра возбуждения, тем самым уменьшив интенсивность возбуждающего света.В других случаях эффекты выцветания можно уменьшить, изменив pH монтажной среды или используя противобесцвечивающие агенты (некоторые из наиболее важных агентов перечислены в таблице 2). Для цифровых изображений, микрофотографии или просто визуального наблюдения быстрое изменение поля зрения также может избежать эффектов выцветания.

Соавторы

Мортимер Абрамовиц — Olympus America, Inc., Драйв двух корпоративных центров., Мелвилл, Нью-Йорк, 11747.

Майкл У. Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 г. Восток Пол Дирак, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

---

НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ВВЕДЕНИЕ

Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.

© 1998-2019, автор — Майкл В. Дэвидсон и Государственный университет Флориды. Все права защищены.Никакие изображения, графика, сценарии или апплеты не могут быть воспроизведены или использованы каким-либо образом без разрешения владельцев авторских прав. Использование этого веб-сайта означает, что вы соглашаетесь со всеми юридическими положениями и условиями, изложенными владельцами.

Этот веб-сайт поддерживается нашей командой
по графике и веб-программированию
в сотрудничестве с оптической микроскопией в Национальной лаборатории сильного магнитного поля
.

Последнее изменение: вторник, 11 сентября 2018 г.

No related posts.