Флуоресцентная это: Флуоресцентные краски — что это?

Содержание

Флуоресцентная микроскопия: принципы метода

Поглощение и дальнейшее переизлучение света неорганическими и органическими средами является результатом фосфоресценции или флуоресценции. Разница между феноменами состоит в продолжительности интервала между световым поглощением и испусканием потока. При флуоресценции эти процессы происходят практически одновременно, а при фосфоресценции – с некоторым опозданием.

Историческая справка

В 1852 г. британский ученый Стокс впервые описал флуоресценцию. Он ввел новый термин в результате выполненных экспериментов с плавиковым шпатом, который испускал красный свет под воздействием ультрафиолета. Стокс отметил интересное явление. Он выявил, что длина волны при флуоресцентном излучении всегда больше, чем у потока света возбуждения.

Для подтверждения гипотезы в 19-м столетии было проведено множество экспериментов. Они показали, что разнообразные образцы флуоресцируют под действием ультрафиолета. Среди материалов, в числе прочего, были кристаллы, смолы, минералы, хлорофилл, лекарственное сырье, неорганические соединения, витамины, масла. Непосредственное же применение красителей для проведения биологических анализов началось только в 1930 г.

Флуоресцентная микроскопия: описание

Некоторые из материалов, использованных в исследованиях первой половины 20-го столетия, обладали высокой специфичностью. Благодаря показателям, которые не могли быть достигнуты контрастными способами, метод флуоресцентной микроскопии стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Немаловажное значение полученные результаты имели и для материаловедения.

Какие преимущества имеет метод флуоресцентной микроскопии? С помощью новых материалов стало возможным выделение высокоспецифичных клеток и субмикроскопических компонентов. Флуоресцентный микроскоп позволяет обнаружить отдельные молекулы. Разнообразные красители позволяют идентифицировать несколько элементов одновременно. Несмотря на ограниченность пространственного разрешения оборудования дифракционным пределом, который, в свою очередь, зависит от специфических свойств образца, выявление молекул ниже этого уровня также вполне возможно. Различные образцы после облучения проявляют автофлуоресценцию. Это явление достаточно широко применяется в петрологии, ботанике, полупроводниковой промышленности.

Особенности

Изучение животных тканей либо патогенных микроорганизмов зачастую осложняется или слишком слабой, или очень сильной неспецифичной автофлуоресценцией. Однако значение в исследованиях приобретает внесение в материал компонентов, возбуждаемых на конкретной длине волны и испускающих световой поток необходимой интенсивности. Флуорохромы выступают в качестве красителей, способных самостоятельно прикрепляться к структурам (невидимым или видимым). При этом они отличаются высокой избирательностью относительно мишеней и квантовым выходом.

Флуоресцентная микроскопия стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Они обладали определенными профилями интенсивности испускания и возбуждения и были нацелены на конкретные биологические мишени.

Выявление отдельных молекул

Часто в идеальных условиях можно зарегистрировать свечение отдельного элемента. Для этого, кроме прочего, нужно обеспечить достаточно низкий шум детектора и оптический фон. Молекула флуоресцеина до разрушения вследствие фотообесцвечивания может испускать до 300 тыс. фотонов. При 20 % собираемости и эффективности процесса их можно зарегистрировать в количестве порядка 60 тыс.

Флуоресцентная микроскопия, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут.

Сложности

Ключевой проблемой выступает подавление шума от оптического фона. В связи с тем, что многие из материалов, используемых в конструкции фильтров и линз, проявляют некоторую автофлуоресценцию, усилия ученых на начальных этапах были ориентированы на выпуск компонентов, обладающих малой флуоресценцией. Однако последующие эксперименты привели к новым выводам. В частности, было установлено, что флуоресцентная микроскопия, основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока.

Механизм

Принципы флуоресцентной микроскопии, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Она возникает на границе сред с различными показателями преломления. В данном случае световой пучок проходит сквозь призму. Она обладает высоким параметром преломления.

Призма прилегает к водному раствору или стеклу с низким параметром. Если поток света направляется на нее под углом, который больше критического, пучок полностью отражается от границы раздела. Это явление, в свою очередь, вызывает нераспространяющуюся волну. Другими словами, генерируется электромагнитное поле, проникающее в среду с меньшим параметром преломления на расстояние меньше 200 нанометров.

В нераспространяющейся волне интенсивность света будет вполне достаточной для возбуждения флуорофоров. Однако вследствие ее исключительно незначительной глубины его объем будет очень малым. В результате возникает низкоуровневый фон.

Модификация

Флуоресцентная микроскопия, основанная на полном внутреннем отражении, может реализовываться с помощью эпи-освещения. Для этого необходимы объективы с повышенной числовой апертурой (как минимум 1.4, однако желательно, чтобы она достигала 1.45-1.6), а также частично освещенное поле аппарата. Последнее достигается с помощью пятна небольшого размера. Для большей равномерности используется тонкое кольцо, посредством которого блокируется часть потока. Для получения критического угла, после которого возникает полное отражение, нужен высокий уровень преломления иммерсионной среды в линзах и покровного стекла микроскопа.

Флуоресценция в науках о жизни - Fluorescence in the life sciences

Флуоресценция обычно используется в науках о жизни как неразрушающий способ отслеживания или анализа биологических молекул с помощью флуоресценции. Некоторые белки или небольшие молекулы в клетках обладают естественной флуоресценцией, что называется собственной флуоресценцией или аутофлуоресценцией (например, НАДН , триптофан или эндогенный хлорофилл , фикоэритрин или зеленый флуоресцентный белок ). Альтернативно, специфические или общие белки, нуклеиновые кислоты , липиды или небольшие молекулы могут быть «помечены» внешним флуорофором , флуоресцентным красителем, который может быть небольшой молекулой, белком или квантовой точкой . Существует несколько методов использования дополнительных свойств флуорофоров , таких как резонансный перенос энергии флуоресценции , когда энергия передается безызлучательно конкретному соседнему красителю, что позволяет обнаруживать близость или активацию белка; другой - изменение свойств, таких как интенсивность, определенных красителей в зависимости от среды, в которой они находятся, что позволяет использовать их в структурных исследованиях.

Флуоресценция

Флуоресценция наземных растений в Северной и Южной Америке.

Эта визуализация показывает глобальные данные флуоресценции наземных растений, собранные с 2007 по 2011 год, в сочетании для отображения одного среднего года. Более темным зеленым цветом обозначены области с небольшой флуоресценцией или без нее; более светлый зеленый и белый цвета указывают на области с высокой флуоресценцией. Сравниваются флуоресценция и нормализованный разностный вегетационный индекс (NDVI).

Принцип флуоресценции заключается в том, что флуоресцентная составляющая содержит электроны, которые могут поглощать фотон и на короткое время переходить в возбужденное состояние, прежде чем либо рассеять энергию без излучения, либо испустить ее как фотон , но с меньшей энергией, т. Е. С большей длиной волны ( длина волны и энергия обратно пропорциональны). Разница в длинах волн возбуждения и излучения называется стоксовым сдвигом , а время, которое требуется возбужденному электрону для излучения фотона, называется временем жизни . Квантовый выход является показателем эффективности красителя (это отношение испускаемых фотонов на поглощенный фотон), а коэффициент экстинкции количество света , которое может быть поглощено флуорофором. Как квантовый выход, так и коэффициент экстинкции являются индивидуальными для каждого флуорофора, и их умножение позволяет рассчитать яркость флуоресцентной молекулы.

Маркировка

Реактивные красители

Флуорофоры могут быть присоединены к белкам через определенные функциональные группы, такие как:

или неспецифично ( глутаральдегид ) или нековалентно ( например, через гидрофобность и т.д.).

Эти флуорофоры представляют собой небольшие молекулы, белки или квантовые точки.

Органические флуорофоры флуоресцируют благодаря делокализованным электронам, которые могут перескакивать через полосу и стабилизировать поглощенную энергию, поэтому большинство флуорофоров являются сопряженными системами . Несколько семей выходят, и их возбуждение варьируется от инфракрасного до ультрафиолетового .
Лантаноиды (хелатный) однозначно флуоресцентные металлы, которые излучают благодаря переходам с 4 F орбиты, которые запрещены, следовательно , они имеют очень низкие коэффициенты поглощения и медленные выбросы, требуя возбуждения через флуоресцентные органические комплексоны (

например , dipicolinate основанный тербий (III) энтеросорбенты ).
Третий класс небольшой молекулы флуорофоры является то , что из переходного металла -лиганда комплексов , которые отображают молекулярные флуоресценции от заряда состояния передачи металла-лиганда , который частично запрещен, они , как правило , комплексы рутения , рений или осмия .

Квантовые точки

Квантовые точки - это флуоресцентные полупроводниковые наночастицы .

Флуоресцентные белки

В природе существует несколько флуоресцентных белков, но наиболее важным в качестве инструмента исследования является зеленый флуоресцентный белок (GFP) медузы Aequorea victoria , который спонтанно флуоресцирует при сворачивании через специфические остатки серин-тирозин-глицин. Преимущество GFP и других флуоресцентных белков по сравнению с органическими красителями или квантовыми точками заключается в том, что они могут экзогенно экспрессироваться в клетках отдельно или в виде слитого белка , белка, который создается путем лигирования флуоресцентного гена (например, GFP) с другим геном и экспрессия которых управляется промотором гена домашнего хозяйства или другим специфическим промотором. Этот подход позволяет использовать флуоресцентные белки в качестве репортеров для любого количества биологических событий, таких как субклеточная локализация и паттерны экспрессии . Вариант GFP в природе встречается у кораллов , в частности у Anthozoa , и было создано несколько мутантов, которые охватывают видимый спектр и флуоресцируют дольше и стабильнее. Другие белки являются флуоресцентными, но требуют кофактора флуорофора и, следовательно, могут использоваться только

in vitro ; они часто встречаются в растениях и водорослях (фитофлюоры, фикобилипротеины, такие как аллофикоцианин ).

Биолюминесценция и флуоресценция

Флуоресценция , хемилюминесценция и фосфоресценция - это 3 различных типа люминесцентных свойств, то есть испускание света веществом. Флуоресценция - это свойство, при котором свет поглощается и излучается в течение нескольких наносекунд (примерно 10 нс) при более низкой энергии (= более высокой длине волны), в то время как биолюминесценция - это биологическая хемилюминесценция , свойство, при котором свет генерируется химической реакцией фермента на субстрат. Фосфоресценция является свойством материалов поглощать свет и испускать энергию , несколько миллисекунд или более поздних (из - за запрещенные переходы в основном состояние в виде триплетного состояния , в то время как флуоресценция происходит в возбужденных синглетных состояниях ). До недавнего времени не применялся в исследованиях в области биологических наук из-за размера неорганических частиц. Однако граница между флуоресценцией и фосфоресценцией не является четко очерченной, поскольку комплексы переходный металл- лиганд, которые объединяют металл и несколько органических фрагментов, имеют длительные времена жизни, до нескольких микросекунд (поскольку они демонстрируют смешанные синглетно-триплетные состояния).

Сравнение с радиоактивностью

До его широкого использования в последние три десятилетия наиболее распространенным ярлыком была радиоактивность .

Преимущества флуоресценции перед радиоактивными метками заключаются в следующем:

  • Флуоресценция более безопасна в использовании и не требует радиологического контроля.
  • Одновременно можно использовать несколько флуоресцентных молекул при условии, что они не перекрываются, ср. FRET, тогда как с радиоактивностью могут использоваться два изотопа ( тритий и изотоп с низкой энергией, такой как 33 P из-за разной интенсивности), но для этого требуется специальное оборудование (тритиевый экран и обычный люминофорный экран для отображения или специальный двухканальный детектор).

Примечание: канал похож на «цвет», но отличается, это пара фильтров возбуждения и излучения, специфичных для красителя, например, микроматрицы Agilent являются двухканальными, работают на cy3 и cy5, они в просторечии называются зеленым и красным.

Флуоресценция не обязательно более удобна в использовании, поскольку для нее требуется собственное специализированное оборудование для обнаружения. Для неколичественных или относительных количественных измерений это может быть полезно, но оно плохо подходит для проведения абсолютных измерений из-за тушения флуоресценции , тогда как измерение радиоактивно меченных молекул всегда является прямым и высокочувствительным.

К недостаткам флуорофоров можно отнести:

  • Значительно изменяет свойства молекулы с флуоресцентной меткой.
  • Вмешательство в нормальные биологические процессы
  • Токсичность

Дополнительные полезные свойства

Основное свойство флуоресценции широко используется, например, маркер меченых компонентов в клетках ( флуоресцентная микроскопия ) или индикатор в растворе ( флуоресцентная спектроскопия ), но другие дополнительные свойства, не обнаруженные при радиоактивности, делают его еще более широко используемым.

FRET

Мультфильм FRET между двумя белка , взаимодействующего белка, метили флуоресцеина и тетраметилсвинца родамина

FRET (резонансная передача энергии Ферстера) - это свойство, при котором энергия возбужденного электрона одного флуорфора, называемого донором, передается ближайшему акцепторному красителю, либо темному тушителю, либо другому флуорофору, спектр возбуждения которого перекрывается со спектром излучения донорного красителя, что приводит к снижению флуоресценции. Это можно использовать для:

  • определить, вступают ли в контакт два меченых белка или нуклеиновых кислоты или гидролизуются ли одиночные молекулы с двойной меткой;
  • обнаруживать изменения экстерьера;
  • измерить концентрацию с помощью анализа конкурентного связывания.

Чувствительность к окружающей среде

Пример экологически чувствительного красителя: Бадан демонстрирует большое изменение дипольного момента при возбуждении (из-за внутреннего переноса заряда между третичным амином и кетоном). Это приводит к значительному снижению энергии релаксации растворителя.

Чувствительные к окружающей среде красители меняют свои свойства (интенсивность, период полураспада, спектры возбуждения и излучения) в зависимости от полярности (гидрофобности и заряда) окружающей среды. Примеры включают: индол , каскад желтый, продан, дансил, дапоксил, NBD, PyMPO, пирен и диэтиламинокумарин.
Это изменение наиболее заметно, когда электронодонорные и электроноакцепторные группы размещаются на противоположных концах ароматической кольцевой системы, поскольку это приводит к большому изменению дипольного момента при возбуждении.

Когда флуорофор возбужден, он обычно имеет больший дипольный момент (μ E ), чем в основном состоянии (μ G ). Поглощение фотона флуорофором занимает несколько пикосекунд. Перед выделением этой энергии (излучение: 1–10 нс) молекулы растворителя, окружающие флуорофор, переориентируются (10–100 пс) из-за изменения полярности в возбужденном синглетном состоянии; этот процесс называется релаксацией растворителя. В результате этой релаксации энергия возбужденного состояния флуорофора понижается (более длинная длина волны), следовательно, флуорофоры, которые имеют большое изменение дипольного момента, имеют большие изменения стоксового сдвига в различных растворителях. Разницу между уровнями энергии можно примерно определить с помощью уравнения Липпера-Матаги.

Гидрофобным краситель представляет собой краситель , который нерастворим в воде, свойство , не зависящий от сольватохромии.
Кроме того, термин « чувствительный к окружающей среде» в химии на самом деле описывает изменения, вызванные одним из множества различных факторов окружающей среды, таких как pH или температура, а не только полярностью; однако в биохимии чувствительный к окружающей среде флуорфор и сольватохромный флуорофор используются взаимозаменяемо: это соглашение настолько широко распространено, что поставщики описывают их как чувствительные к окружающей среде, а не сольватохромные.

Время жизни флуоресценции

Флуоресцентные фрагменты излучают фотоны через несколько наносекунд после поглощения, следуя экспоненциальной кривой затухания, которая различается для разных красителей и зависит от окружающего растворителя. Когда краситель присоединяется к макромолекулам, кривая распада становится многоэкспоненциальной. Конъюгированные красители обычно имеют время жизни от 1 до 10 нс, существует небольшое количество более долгоживущих исключений, в частности, пирен со временем жизни 400 нс в дегазированных растворителях или 100 нс в липидах и коронен с 200 нс. К другой категории флуорфоров относятся флуоресцентные металлоорганические соединения (лантаноиды и комплексы переходный металл-лиганд), которые были описаны ранее , которые имеют гораздо более длительный срок службы из-за ограниченных состояний: лантаноиды имеют время жизни от 0,5 до 3 мс, а переходный металл-лиганд комплексы имеют время жизни от 10 нс до 10 мкс. Обратите внимание, что срок службы флуоресценции не следует путать со сроком службы фотодеструкции или «сроком годности» красителя.

Многофотонное возбуждение

Многофотонное возбуждение - это способ фокусировки плоскости обзора микроскопа с использованием преимущества явления, когда два фотона с низкой энергией одновременно поглощаются флуоресцентной составляющей, которая обычно поглощает один фотон с удвоенной индивидуальной энергией: скажем, два фотона в ближнем ИК-диапазоне (800 нм) для возбуждения УФ-красителя (400 нм).

Анизотропия флуоресценции

Совершенно неподвижная флуоресцентная составляющая при возбуждении поляризованным светом будет излучать свет, который также поляризован. Однако, если молекула движется, она будет «искажать» поляризацию света, излучая падающий свет в другом направлении.

Методы

  • Флуоресцентная микроскопия тканей, клеток или субклеточных структур выполняется путем мечения антитела флуорофором и предоставления антителу возможности найти свой антиген-мишень в образце. Маркировка нескольких антител разными флуорофорами позволяет визуализировать несколько мишеней на одном изображении.
  • Автоматическое секвенирование ДНК методом обрыва цепи ; каждое из четырех различных оснований, завершающих цепь, имеет свою собственную специфическую флуоресцентную метку. Когда меченые молекулы ДНК разделены, флуоресцентная метка возбуждается УФ-источником, и идентичность основания, завершающего молекулу, определяется длиной волны испускаемого света.
  • Обнаружение ДНК: соединение бромистого этидия , когда оно свободно изменяет свою конформацию в растворе, имеет очень слабую флуоресценцию. Флуоресценция бромистого этидия значительно усиливается, когда он связывается с ДНК, поэтому это соединение очень полезно для визуализации местоположения фрагментов ДНК при электрофорезе в агарозном геле . Бромистый этидий может быть токсичным - якобы более безопасной альтернативой является краситель SYBR Green .
  • ДНК микрочипов .
  • Иммунология: к антителу присоединена флуоресцентная химическая группа, и участки (например, на микроскопическом образце), где связывалось антитело, можно увидеть и даже количественно оценить по флуоресценции.
  • FACS ( сортировка флуоресцентно-активируемых клеток ).
  • Микромасштабный термофорез (MST) использует флуоресценцию в качестве считывающего устройства для количественной оценки направленного движения биомолекул в микроскопических температурных градиентах.
  • Флуоресценция использовалась для изучения структуры и конформации ДНК и белков с помощью таких методов, как резонансный перенос энергии флуоресценции , который измеряет расстояние на уровне ангстрем. Это особенно важно в комплексах из множества биомолекул.
  • Флуоресценцию можно применять для изучения совместной локализации различных интересующих белков. Затем его можно проанализировать с помощью специального программного обеспечения, такого как CoLocalizer Pro .

Кроме того, многие биологические молекулы обладают собственной флуоресценцией, которую иногда можно использовать без необходимости прикрепления химической метки. Иногда эта собственная флуоресценция изменяется, когда молекула находится в определенном окружении, поэтому распределение или связывание молекулы можно измерить. Например, билирубин обладает высокой флуоресценцией, когда он связывается с определенным участком сывороточного альбумина. Протопорфирин цинка , образующийся в развивающихся красных кровяных тельцах вместо гемоглобина, когда железо недоступно или присутствует свинец, имеет яркую флуоресценцию и может использоваться для обнаружения этих проблем.

Количество применений флуоресценции в биомедицинских, биологических и смежных науках постоянно расширяется. Методы анализа в этих областях также развиваются, часто с номенклатурой в виде таких сокращений, как: FLIM , FLI, FLIP , CALI, FLIE, FRET , FRAP , FCS , PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP или TIRF. . Большинство этих методов основаны на флуоресцентных микроскопах, в которых используются источники света высокой интенсивности, обычно ртутные или ксеноновые лампы, светодиоды или лазеры, для возбуждения флуоресценции в исследуемых образцах. Затем оптические фильтры отделяют возбуждающий свет от испускаемой флуоресценции, которую необходимо обнаружить глазом, камерой (ПЗС) или другим детектором света (например, фотоэлектронными умножителями, спектрографами). В настоящее время проводятся обширные исследования, направленные на улучшение возможностей таких микроскопов, используемых флуоресцентных зондов и областей применения, в которых они применяются. Особо следует отметить конфокальные микроскопы, в которых для получения оптических срезов используется точечное отверстие , которое позволяет получить количественное трехмерное изображение образца.

Смотрите также

Рекомендации

Флуоресцентная визуализация - Fluorescence imaging

Многоцветное флуоресцентное изображение живых клеток HeLa

Флуоресцентная визуализация - это тип неинвазивной техники визуализации, которая может помочь визуализировать биологические процессы , происходящие в живом организме. Изображения могут быть получены с помощью различных методов, включая микроскопию , визуализационные зонды и спектроскопию .

Сама по себе флуоресценция - это форма люминесценции, которая возникает в результате испускания веществом света определенной длины волны после поглощения электромагнитного излучения . Молекулы, которые повторно излучают свет при поглощении света, называются флуорофорами .

Флуоресцентная визуализация позволяет сфотографировать флуоресцентные красители и флуоресцентные белки, чтобы отметить молекулярные механизмы и структуры. Это позволяет экспериментально наблюдать динамику экспрессии генов , экспрессии белков и молекулярных взаимодействий в живой клетке. По сути, он служит точным количественным инструментом для биохимических применений.

Распространенное заблуждение, флуоресценция отличается от биолюминесценции тем, как белки в каждом процессе производят свет. Биолюминесценция - это химический процесс, при котором ферменты расщепляют субстрат для получения света. Флуоресценция - это физическое возбуждение электрона и последующее возвращение к излучению света.

Атрибуты

Механизм флуоресценции

Диаграмма, показывающая связь между поглощением и флуоресценцией

Когда определенная молекула поглощает свет, энергия молекулы ненадолго повышается до более высокого возбужденного состояния. Последующее возвращение в основное состояние приводит к испусканию флуоресцентного света, который можно обнаружить и измерить. Излучаемый свет, возникающий в результате поглощения фотона с энергией hv , имеет определенную длину волны. Важно знать эту длину волны заранее, чтобы во время эксперимента измерительное устройство знало, на какой длине волны нужно установить световое излучение. Эта длина волны определяется уравнением:

λемяssяопзнак равно часcEпергуемяssяоп{\ displaystyle \ lambda _ {выбросы} = \ {\ frac {hc} {{энергия} _ {выбросы}}}}

Где h = постоянная Планка, а c = скорость света. Обычно здесь используется большое сканирующее устройство или ПЗС-матрица для измерения интенсивности и цифрового фотографирования изображения.

Флуоресцентные красители против белков

Флуоресцентные красители, не имеющие времени созревания, обладают более высокой фотостабильностью и яркостью по сравнению с флуоресцентными белками. Что касается яркости, светимость зависит от коэффициента экстинкции флуорофоров или способности поглощать свет, а также от его квантовой эффективности или эффективности преобразования поглощенного света в люминесцентное свечение. Сами красители не очень флуоресцируют, но когда они связываются с белками, их легче обнаружить. Один из примеров, NanoOrange, связывается с покрывающими и гидрофобными областями белка, будучи невосприимчивым к восстанавливающим агентам. Что касается белков, эти молекулы сами флуоресцируют, когда они поглощают определенную длину волны падающего света. Один из примеров этого, зеленый флуоресцентный белок (GFP), флуоресцирует зеленым при воздействии света в диапазоне от синего до УФ. Флуоресцентные белки - отличные репортерные молекулы, которые могут помочь в локализации белков, наблюдении за связыванием белков и количественной оценке экспрессии генов.

Диапазон изображений

Поскольку некоторые длины волн флуоресценции находятся за пределами диапазона человеческого глаза, для точного обнаружения света и отображения излучения используются устройства с зарядовой связью (ПЗС). Обычно это происходит в диапазоне 300-800 нм. Одним из преимуществ флуоресцентной передачи сигналов является то, что интенсивность излучаемого света довольно линейно зависит от количества предоставленных флуоресцентных молекул. Очевидно, это зависит от того, что интенсивность и длина волны поглощенного света постоянны. Что касается самого изображения, оно обычно находится в 12-битном или 16-битном формате данных.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) освещается УФ-светом у трех лабораторных мышей

Системы визуализации

Основными компонентами систем флюоресцентной визуализации являются:

  • Источник возбуждения - устройство, которое производит либо источник с широкой длиной волны, например УФ-свет, либо источник с узкой длиной волны, такой как лазер.
  • Световая оптика дисплея - механизм, свет которого освещает образец. Обычно это делается путем прямого освещения образца.
  • Световая ассортиментная оптика - метод сбора самого света. Обычно это линзы, зеркала и фильтры.
  • Фильтрация излучаемого света - оптические фильтры гарантируют, что отраженный и рассеянный свет не будет включен в флуоресценцию. Три класса эмиссионных фильтров: длиннопроходные, короткочастотные и полосовые.
  • Обнаружение, усиление и визуализация - фотоумножитель (ФЭУ) или устройство с зарядовой связью (ПЗС) используются для обнаружения и количественного определения испускаемых протонов.

Приложения

  • В ПЦР (электрофорез в агарозном геле) SYBR Green - очень распространенный краситель, который связывается с ДНК и используется для визуализации полос ДНК в агарозном геле. Краситель поглощает синий свет и флуоресцирует зеленым, что позволяет системе визуализации.
  • Блоттинг (Вестерн, Нозерн и Саузерн) - флуорохромы могут связываться с антителами, РНК и ДНК для флуоресценции и количественной оценки данных
  • Секвенирование ДНК - секвенирование по Сэнгеру - это распространенная форма обнаружения нуклеиновых кислот, которая может использовать флуоресцентно меченые ддНТФ для изображения пиков флуоресценции.
  • Хирургия под контролем флуоресцентного изображения - это метод медицинской визуализации, при котором флуоресцентная метка массы помогает в навигации. Например, индоцианин зеленый можно использовать для обнаружения лимфатических узлов у онкологических больных.
  • Флуоресцентная визуализация с точностью до одного нанометра (FIONA) - использует освещение полного внутреннего отражения для уменьшения шума и увеличения яркости флуорофоров
  • Визуализация кальция - методика, в которой используются флуоресцентные молекулы, называемые индикаторами кальция, которые изменяют флуоресценцию при связывании с ионами Ca 2+ . Это ключевая часть наблюдения за активностью клеток нервной системы.
Агарозный гель с использованием бромистого этидия в качестве флуоресцентной метки при УФ-освещении

Виды микроскопии

Для изменения визуализации и контрастности изображения можно использовать другой набор микроскопических методов. У каждого метода есть свои плюсы и минусы, но все они используют один и тот же механизм флуоресценции для наблюдения за биологическим процессом.

  • Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения - это метод микроскопии, в котором используются затухающие волны для выборочного наблюдения флуоресценции отдельной молекулы.
  • Флуоресцентная микроскопия светового листа - это метод флуоресцентной микроскопии, который освещает тонкий срез образца под перпендикулярным углом исследования.
  • Визуализирующая микроскопия за время жизни флуоресценции - это метод визуализации, при котором регистрируются изменения флуоресценции с течением времени.

Преимущества

  • Неинвазивная визуализация in vivo может выполняться без прокола кожи
  • Чувствительные зонды разработаны так, чтобы быть чрезвычайно чувствительными к обнаружению биологических молекул, таких как ДНК, РНК и белки.
  • Мульти-маркировка - в образцах можно обнаружить несколько флуорохромов, что упрощает интеграцию стандартов и контроля.
  • Стабильность меченых молекул - флуоресцентно меченые молекулы, используемые для визуализации, могут храниться в течение нескольких месяцев, в то время как другие молекулы, подобные тем, которые имеют радиоактивную метку, будут распадаться в течение нескольких дней.
  • Относительно безопасно в обращении - с большинством флуорофоров можно безопасно и в достаточной степени обращаться в перчатках, в то время как, например, для радиоизотопов могут потребоваться свинцовые экраны или другая радиационная защита.
  • Простая утилизация - многие флуорофоры требуют минимальных методов утилизации, в то время как радиоактивные отходы требуют регулируемого захоронения и длительного обращения. Это также помогает снизить затраты, необходимые для использования этих продуктов.
Пример флуоресцентного микроскопа с устройством с заряженной связью (ПЗС) для захвата изображений

Недостатки

  • Фотообесцвечивание - это распространенная проблема флуорофоров, когда постоянное переключение между основным и возбужденным состоянием повреждает молекулу и снижает ее интенсивность.
  • Восприимчивость к окружающей среде - факторы окружающей среды, такие как температура, концентрация ионов и pH, могут влиять на эффективность и излучение флуорохромов.
  • Токсичность - некоторые флуорохромы могут быть токсичными для клеток, тканей in vivo или вызывать мутации.
  • Ограниченная разрешающая способность - флуоресцентные микроскопы ограничены в своей способности различать близкие объекты на макроскопическом уровне. Для сравнения, электронные микроскопы, например, обладают способностью разрешать в гораздо меньшем диапазоне.
  • Ограниченный начальный диапазон светимости - интенсивность падающего источника света имеет предел, выход за пределы которого может привести к фотодеструкции молекул.

В целом, эта форма визуализации чрезвычайно полезна в передовых исследованиях с ее возможностью отслеживать биологические процессы. Переход от двухмерных флуоресцентных изображений к трехмерным позволил ученым лучше изучать пространственную точность и разрешение. Кроме того, сосредоточив усилия на четырехмерном анализе, ученые теперь могут контролировать клетку в режиме реального времени, что позволяет им отслеживать быстро протекающие процессы.

Будущие направления

Различные цвета флуоресценции из диапазона флуоресцентных белков

Разработка более эффективных флуоресцентных белков - это задача, которую взяли на себя многие ученые, чтобы улучшить возможности зонда для визуализации. Часто мутации в определенных остатках могут значительно изменить флуоресцентные свойства белка. Например, за счет мутации гена F64L в GFP медузы белок может более эффективно флуоресцировать при 37 ° C, что является важным свойством при выращивании культур в лаборатории. В дополнение к этому, генная инженерия может производить белок, который излучает свет с лучшей длиной волны или частотой. Кроме того, решающую роль может сыграть сама окружающая среда. Время жизни флуоресценции можно стабилизировать в полярной среде.

Механизмы, которые были хорошо описаны, но не обязательно включены в практические приложения, имеют многообещающий потенциал для флуоресцентной визуализации. Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) - чрезвычайно чувствительный механизм, который производит сигнальные молекулы в диапазоне 1-10 нм.

Улучшения в методах, составляющих процессы флуоресценции, также имеют решающее значение для более эффективных дизайнов. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) - это метод анализа, который отслеживает колебания интенсивности флуоресценции. Этот анализ является составной частью многих устройств для получения флуоресцентных изображений, и улучшение пространственного разрешения может улучшить чувствительность и диапазон.

Разработка более чувствительных зондов и аналитических методов лазерно-индуцированной флуоресценции может позволить получить более точные и современные экспериментальные данные.

Смотрите также

Ссылки

Флуоресцентные красители | Learn & Share

В флуоресцентной микроскопии часто бывает целесообразно окрашивать компартменты клеток, такие как лизосомы или эндосомы, и органеллы, такие как митохондрии. Для этой цели существует палитра специальных красителей, о которых будет сказано в этом разделе.

Одним из хорошо известных способов наблюдения за митохондриями является использование MitoTracker ® . Это проницаемый для клеток краситель с хлорметильным фрагментом, слабо реагирующим с тиолами. С его помощью он может ковалентно связываться с матричными белками, взаимодействуя со свободными тиоловыми группами остатков цистеина.MitoTracker ® существует в различных цветах и ​​модификациях (см. Таблицу 1) и является товарным знаком Molecular Probes. В отличие от традиционных специфических для митохондрий красителей, таких как родамин 123 или тетраметилрозамин , MitoTracker ® не вымывается после разрушения мембранного потенциала фиксаторами.

По данным окрашивания митохондрий, существуют также красители, маркирующие кислотные компартменты, такие как лизосомы, которые называются LysoTracker .Это проницаемые для мембраны слабые основания, связанные с флуорофором. Скорее всего, эти основания имеют сродство к кислотным компартментам из-за протонирования. LysoTrackers также доступны в различных цветах (см. Таблицу 1).

Компартмент, сопоставимый с лизосомами, представляет собой вакуоль у грибов, таких как Saccharomyces cerevisiae . Эти мембранные замкнутые пространства также имеют кислую природу. Одним из способов визуализации этого при флуоресцентной микроскопии является использование красителей на основе стирила, таких как FM 4-64 ® или FM 5-95 ® .

Когда дело доходит до экспериментов по секреции белка, эндоплазматический ретикулум (ER) представляет особый интерес. Один классический краситель для окрашивания этого отсека - DiOC6 (3) . Он отдает предпочтение ЭР, но все же связывается с другими мембранами, такими как мембраны митохондрий. Другой способ специфического окрашивания ER - использовать ER-Trackers , например, ER-Tracker Green и Red. Оба являются красителями на основе BODIPY, которые связаны с глибенкламидом - сульфонилуреазой - которая связывается с чувствительными к АТФ калиевыми каналами, находящимися исключительно в мембране ER. BODIPY (бор-дипиррометен) описывает группу относительно нечувствительных к pH красителей, которые почти все нерастворимы в воде. Это делает их не очень хорошим инструментом для мечения белков, а для мечения липидов и мембран.

Соседний отсек с ER - аппарат Гольджи - можно маркировать флуоресцентными аналогами церамидов, такими как NBD C6-ceramide и BODIPY FL C5-ceramide . Керамиды - это сфинголипиды, которые сильно обогащены аппаратом Гольджи.

С помощью других красителей на липидной основе можно окрашивать особые участки мембраны, такие как липидные рафты. Эти богатые холестерином домены могут быть визуализированы с использованием NBD-6 Cholestrol или NBP-12 Cholesterol среди других (Avanti Polar Lipids).

Помимо использования специальных небелковых флуоресцентных красителей для маркировки клеточных компартментов, также возможно окрашивание интересующей области с помощью белков с предпочтением отдельных участков в клетке.Эти белки могут быть связаны с флуоресцентным красителем и визуализированы в флуоресцентном микроскопе. Одним из примеров такого подхода является использование агглютинина зародышей пшеницы (WGA), который специфически связывается с сиаловой кислотой и N-ацетилглюкозаминилом, присутствующим в плазматической мембране. WGA связан с флуоресцентным красителем. С его помощью можно наблюдать плазматическую мембрану.

Флуоресцентная микроскопия | Olympus Life Science

Обзор раздела:

Флуоресцентное освещение и наблюдение - это наиболее быстро развивающийся метод микроскопии, используемый сегодня как в медицинских, так и в биологических науках, и этот факт стимулировал разработку более сложных микроскопов и многочисленных флуоресцентных аксессуаров.Эпи-флуоресценция, или флуоресценция падающего света, теперь стала предпочтительным методом во многих приложениях и составляет большую часть этого руководства. Мы разделили раздел флуоресценции праймера на несколько категорий, чтобы упростить организацию и загрузку. Пожалуйста, перейдите по ссылкам ниже, чтобы перейти к достопримечательностям.

Обзорные статьи

  • Введение в флуоресцентную микроскопию

    Изучите основные концепции флуоресценции, члена повсеместно распространенного семейства процессов luminescence , в которых восприимчивые молекулы излучают свет из электронно-возбужденных состояний, создаваемых физическим, механическим или химический механизм.

  • Флуоресцентный микроскоп

    В отличие от других режимов оптической микроскопии, основанных на макроскопических характеристиках образца, таких как двойное лучепреломление, флуоресцентная микроскопия способна отображать распределение отдельных молекулярных частиц, основываясь исключительно на свойствах флуоресцентного излучения.

  • Источники света

    Чтобы генерировать достаточную интенсивность возбуждающего света для получения вторичного флуоресцентного излучения, способного обнаруживать, необходимы мощные источники света, такие как ртутные или ксеноновые дуговые (горелочные) лампы.

  • Оптимизация и устранение неполадок

    В этой статье рассматриваются ключевые особенности флуоресцентной микроскопии, такие как обнаружение флуоресцентных объектов, которые могут быть слабо видимыми или очень яркими по сравнению с фоном, а также общие проблемы с конфигурацией микроскопа.

  • Электронные детекторы изображения

    Представленное обсуждение предназначено для помощи в понимании основ обнаружения света и предоставления руководства по выбору подходящего детектора для конкретных применений в флуоресцентной микроскопии.

  • Введение в флуорофоры

    Широкопольная флуоресценция и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия основаны на вторичной флуоресцентной эмиссии как на режиме визуализации, в первую очередь из-за высокой степени чувствительности, обеспечиваемой методами.

  • Флуоресцентные белки оптического хайлайтера

    Оптические хайлайтеры обычно демонстрируют небольшую начальную флуоресценцию или ее отсутствие при возбуждении на длине волны изображения, но увеличивают интенсивность своей флуоресценции после активации путем облучения на другой длине волны.

  • Флуоресцентная микрофотография

    Дополнительная информация о микрофотографии в условиях флуоресцентного освещения может представлять собой уникальный набор обстоятельств, которые могут создать особые проблемы для микроскописта.

  • Практические аспекты комбинаций флуоресцентных фильтров

    Широкий спектр фильтровальных кубиков доступен от большинства основных производителей, которые в настоящее время производят наборы фильтров, способные отображать большинство распространенных флуорофоров, используемых сегодня.

  • Глоссарий терминов по флуоресцентной и конфокальной микроскопии

    Указанный ресурс предоставляется в качестве руководства и справочного инструмента для посетителей, изучающих широкий спектр специализированных тем по флуоресцентной и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

Продвинутые методы флуоресцентной микроскопии

  • Введение в конфокальную микроскопию

    Конфокальная микроскопия дает возможность контролировать глубину резкости, устранять или уменьшать фоновую информацию вдали от фокальной плоскости, а также собирать последовательные оптические срезы из толстых экземпляров.

  • Микроскопия с многофотонным возбуждением

    Многофотонная флуоресцентная микроскопия - это мощный инструмент, сочетающий методы лазерной сканирующей микроскопии с длинноволновым возбуждением многофотонной флуоресценции для получения трехмерных изображений образцов с высоким разрешением.

  • Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)

    Когда метод флуоресцентного резонансного переноса энергии ( FRET ) применяется к оптической микроскопии, он позволяет определить сближение между двумя молекулами в пределах нескольких нанометров.

  • Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

    TIRFM обычно используется для исследования взаимодействия молекул с поверхностями, области, которая имеет фундаментальное значение для широкого спектра дисциплин клеточной и молекулярной биологии.

  • Лазерные системы для оптической микроскопии

    Лазеры, используемые в оптической микроскопии, представляют собой высокоинтенсивные монохроматические источники света, которые используются во многих методах, включая оптический захват, исследования изображений в течение срока службы и восстановление после фотообесцвечивания.

  • Комбинированная флуоресцентная и ДИК-микроскопия

    Флуоресцентную микроскопию можно комбинировать с методами повышения контрастности, такими как освещение DIC , чтобы минимизировать эффекты фотообесцвечивания путем определения определенной интересующей области в образце с помощью DIC .

  • Комбинированная флуоресцентная и фазоконтрастная микроскопия

    Для минимизации фотообесцвечивания флуоресцентную микроскопию можно комбинировать с фазово-контрастным освещением.Идея состоит в том, чтобы определить местонахождение конкретной интересующей области в образце с помощью техники (фазы), а затем, не перемещая образец, переключить микроскоп в режим флуоресценции.

  • Флуоресцентная микроскопия Галерея цифровых изображений

    Образцы, представленные в этой галерее, содержат образцы различных дисциплин, использующих специфические флуорохромные красители и автофлуоресценцию. Изображения были получены с помощью цифровых камер или классической микрофотографии на пленку с 35-миллиметровой прозрачной пленкой Fujichrome Provia.

  • Флуоресцентная микроскопия клеток в культуре Галерея цифровых изображений

    В представленной галерее флуоресцентных изображений исследуется более 30 наиболее распространенных линий клеток, помеченных различными флуорофорами с использованием как традиционных методов окрашивания, так и методов иммунофлуоресценции.

Анатомия флуоресцентного микроскопа

  • Вертикальный микроскоп Olympus BX51

    Узнайте о флуоресцентном микроскопе Olympus BX51, который представляет собой вертикальный эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный вертикальным осветителем, который содержит турель из кубиков фильтра и ртутный или Корпус ксеноновой дуговой лампы.

  • Инвертированный микроскоп Olympus IX70

    Микроскопы с инвертированной рамкой (инвертированный микроскоп Olympus IX70) предназначены для культивирования тканей и способны производить флуоресцентное освещение через эпископический и оптический путь.

Интерактивные учебные пособия по Java

  • Пути света флуоресцентного микроскопа

    Изучите пути освещения в вертикальном микроскопе Olympus BX51 исследовательского уровня.Чертеж микроскопа, представленный в руководстве, иллюстрирует схематическое изображение микроскопа Olympus BX51.

  • Инвертированный микроскоп Световые пути

    Исследуйте световые пути (в Olympus IX70) с помощью инвертированного микроскопа для культуры тканей, оборудованного как диаскопическим (вольфрам-галогеновый), так и эпифлуоресцентным (ртутная дуга) освещением.

Избранные источники литературы

Избранные источники литературы

Область флуоресцентной микроскопии переживает период возрождения с появлением новых методов, таких как конфокальная, многофотонная, деконволюция и полное внутреннее отражение, особенно в сочетании с достижениями в области хромофора и флуорофорная технология.Справочные материалы, перечисленные ниже, были использованы при построении раздела флуоресценции праймера для молекулярных выражений для микроскопии.

Соавторы

Дэниел Аксельрод - Департамент биофизики, 930 North University Ave., Мичиганский университет, Анн-Арбор, штат Мичиган, 48109.

Брайан Херман и Виктория Э. Чентонзе Фрелих - Департамент клеточной и Структурная биология, Центр медицинских наук Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz - Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Douglas B. Мерфи - Отделение клеточной биологии и анатомии и установка микроскопа, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

David W.Поршень - Департамент молекулярной физиологии и биофизики, Университет Вандербильта, 702 Лайт Холл, Нэшвилл, Теннесси, 37212.

Кристофер Харди , Рой Киношита , Трэвис Уэйкфилд , и Роберт Джонсон - Роберт Джонсон ., 210 Main Street, Brattleboro, Vermont, 05301.

Turan Erdogan - Semrock, Inc., 3625 Buffalo Road, Rochester, New York, 14624.

Mortimer Abramowitz, William K.Фестер, Йошихиро Кавано и Рейнхард Г. Эндерс - Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive, Мелвилл, Нью-Йорк, 11747.

Кеннет Р. Спринг - научный консультант, Ласби, Мэриленд, 20657.

Мэтью Дж. Парри-Хилл , Томас Дж. Феллерс и Майкл У. Дэвидсон - Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 г. Ист. Поль Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Флуоресцеин (FITC) | Thermo Fisher Scientific

Производные флуоресцеина являются наиболее распространенными флуоресцентными реагентами для биологических исследований из-за их высокой поглощающей способности, отличного квантового выхода флуоресценции и хорошей растворимости в воде.

Красители на основе флуоресцеина и их конъюгаты обладают несколькими характеристиками, которые могут облегчить или ограничить использование в определенных областях. Флуоресцеиновые дисплеи:

  • Относительно высокая скорость фотообесцвечивания
  • Флуоресцентный сигнал, чувствительный к изменениям pH
  • Относительно широкий спектр излучения флуоресценции
  • Тушение флуоресценции при конъюгации с биополимерами
Мы предлагаем широкий спектр конъюгатов и производных флуоресцеина, а также серию высокоэффективных флуорофоров с улучшенными характеристиками для мечения и обнаружения.

Флуоресцеиновые продукты

Мы предлагаем широкий спектр флуоресцентных продуктов, включая наборы для маркировки белков и антител, конъюгаты первичных и вторичных антител, биоконъюгаты и многое другое.

Подробнее здесь:

Флуоресцеиновые красители

Выберите химический состав для маркировки красителем для конъюгации со следующими реактивными группами:

Наборы для маркировки флуоресцеиновых белков / антител

Выберите оптимизированный набор для маркировки целевого антитела или белка:

Высокоэффективные альтернативы флуоресцеину

Флуоресцентные конъюгаты

Молекулярные зонды Invitrogen Краситель Alexa Fluor 488 - со спектральными свойствами и квантовым выходом, почти идентичными свойствам и квантовому выходу флуоресцеина изотиоцианата (FITC), дает более яркие и фотостабильные конъюгаты.Эти конъюгаты идеально подходят для визуализации и других приложений, требующих повышенной чувствительности и экологически нечувствительного к флуоресценции обнаружения.

Мониторинг pH

Для мониторинга pH Invitrogen Molecular Probes pHrodo Green краситель почти не флуоресцирует при нейтральном pH и ярко флуоресцирует в кислой среде. В отличие от флуоресцеина, минимальная флуоресценция красителя при нейтральном pH также устраняет необходимость в стадиях промывки и тушительных красителях, потому что любой неинтернализованный краситель будет практически нефлуоресцентным.

Сравнение относительной флуоресценции конъюгатов козьих антимышиных антител IgG, полученных из красителя Alexa Fluor 488 и изотиоцианата флуоресцеина (FITC). Флуоресценцию конъюгата определяют путем измерения квантового выхода флуоресценции конъюгированного красителя по сравнению с эталонным красителем и умножения на соотношение мечения краситель: белок.

ресурсов

5 шагов ресурсы

]]]]]]>]]]]>]]>

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *