Дизайн евродвушки 46 кв м фото: Дизайн квартиры 46 кв. м.

Арун Ричард Чандрасекаран

¹ Confer Health, Inc., Чарлстаун, Массачусетс 02143, США

Дэвид А. Руслинг

² Институт биологических наук о жизни , Саутгемптонский университет, Саутгемптон, Хэмпшир SO17 1BJ, Великобритания

¹ Confer Health, Inc., Чарлстаун, Массачусетс 02143, США

² Биологические науки, Институт наук о жизни, Саутгемптонский университет, Саутгемптон, Хэмпшир SO17 1BJ, UK

Поступило 28 августа 2017 г .; Пересмотрено 21 ноября 2017 г .; Принято, 2017 г. 30 ноября.

Abstract

Самосборка ДНК оказалась полезной восходящей стратегией для создания определяемых пользователем наноразмерных объектов, решеток и устройств. Дизайн этих структур в значительной степени основан на использовании простых правил спаривания оснований и формировании двухспиральных доменов в качестве вторичных структурных элементов.Однако другие спиральные формы, включающие специфические неканонические взаимодействия оснований и оснований, внесли новую парадигму в процесс инженерии с ДНК. Наиболее примечательным из них является трехцепочечный комплекс, образованный связыванием третьей цепи в большой бороздке дуплекса, образующий трехспиральную («триплексную») структуру. Требования к последовательности, структуре и сборке, которые отличают триплексы от их дуплексных аналогов, позволили разработать наноструктуры как для динамических, так и / или структурных целей, а также средства нацеливания компонентов, не являющихся нуклеиновыми кислотами, в точные места в каркасе наноструктуры.Здесь мы рассматриваем свойства триплексов, которые оказались полезными в разработке наноструктур ДНК, с акцентом на приложения, которые до сих пор были невозможны только за счет образования дуплексов.

ВВЕДЕНИЕ (В НАНОТЕХНОЛОГИИ ДНК)

ДНК оказалась универсальным полимером для направленной самосборки заказных 2D- и 3D-объектов, массивов и устройств, обладающих характеристиками нанометрового масштаба (1,2). Высокая точность и программируемость пар оснований Watson – Crick (W – C) позволяет надежно использовать двухспиральные домены в качестве вторичных структурных элементов (рисунок).Как следствие, инженерия с ДНК потребовала разработки мотивов, которые подчиняются внутренней последовательности и геометрическим свойствам отдельных дуплексов W – C, а также необходимости определенного решения и условий сборки. Доступны различные топологии за счет использования естественного шага спирали B-формы ( ~ . 10,5 пар оснований / виток), полярности нитей 5′-3 ‘и расположения пересечений нитей между соседними спиралями (рисунок). Листы спиралей могут быть созданы путем расположения пересечений на расстоянии целого числа полуспиральных витков друг от друга (например,грамм. Рисунок а) (3,4). Такие листы могут быть уложены в гексагональные (5,6) или квадратные решетки (7) путем введения нескольких пересечений между многими или всеми спиралями, в то время как листы или отдельные спирали можно запрограммировать для проецирования под разными углами, сдвигая регистр пересечений вдоль смежные межспиральные интерфейсы (например, рисунки и) (8–10). Возможности также могут быть внесены путем изменения длины соседних доменов и / или принудительного отклонения от естественной плотности скручивания (11,12). Структуры могут быть собраны посредством гибридизации нескольких коротких олигонуклеотидов (3,5,8,9) или складывания длинного одноцепочечного каркаса (обычно генома из 7249 нуклеотидов вируса M13mp18) с помощью нескольких коротких цепей (‘скобки ‘), так называемое ДНК-оригами (4,6,7,10–12).Размер этих структур, часто называемых плитками, может быть увеличен более чем на пять порядков за счет коаксиальной сборки сегментов с тупыми (13) или липкими концами (14–16) и сопутствующего образования дуплексов, содержащих неоднородности (‘ nicks ‘) в их фосфодиэфирных скеллах (например, рисунок, и). Стабильность таких многонитевых структур повышается за счет наличия различных противоионов, которые экранируют высокую степень отталкивания отрицательных зарядов (например, Na ⁺ или Mg ²⁺ ) (17), а также могут принимать участие в сворачивании. процесс (18).Кроме того, минимизация симметрии последовательности (19), компьютерное проектирование (20) и управление протоколами отжига (21) могут использоваться для ограничения выхода нежелательных комплексов, таких как те, которые образуются из-за непреднамеренного несоответствия пар оснований. Все больше заявлений о применении этих дизайнерских комплексов, в том числе их использование в диагностике, обнаружении и терапии, в качестве наномеханических устройств, а также для точного позиционирования компонентов, не являющихся нуклеиновыми кислотами, в 2D- и 3D-пространстве (1,2). .

Двойная спираль как вторичный структурный элемент: структурные мотивы, собранные через одинарные ( A ), двойные ( B ) и множественные ( C – E ) пересечения цепей между соседними двойными спиральными доменами. Размер этих структур может быть увеличен за счет соответствующего расположения дополнительных однонитевых выступов (липких концов): (B) 2D-массив, созданный из ~ . 10 ⁶ копий молекулы двойного кроссовера; (D) тетраэдр, собранный из четырех копий трехконечной звезды; и (E) 3D кристалл, образованный из ~ .10 ¹² копий мотива треугольника тенсегрити. Однослойные структуры, показанные на (B) и (C), были получены с помощью атомно-силовой микроскопии; тетраэдрическая структура, показанная на (D), была реконструирована на основе анализа криоэлектронной микроскопии; в то время как кристалл, показанный на (E), был получен с помощью световой микроскопии, а его основная структура ДНК позже была определена с помощью рентгеноструктурного анализа. Зигзагообразные линии на (A) представляют собой полувинты, а стрелки отражают полярность 5′-3 ‘нитей. По возможности непересекающиеся нити показаны золотом, а цилиндры обозначают области двойной спирали в каждом мотиве.Адаптировано из (4,9,14,15) с разрешения.

Очевидно, что успех нанотехнологии ДНК является свидетельством и основывается на последовательности и структурных особенностях двойной спирали, впервые описанных Уотсоном и Криком более 60 лет назад (22). Однако известно, что ДНК принимает множество других спиральных форм, включая специфические неканонические взаимодействия оснований и оснований (23). Последовательность, структурные и сборочные требования, которые отличают эти комплексы от их дуплексных аналогов, вводят новую парадигму в процесс инженерии с ДНК (24).Возможно, наиболее часто используемая из этих структур — тройная спираль: трехцепочечный комплекс, генерируемый связыванием третьей цепи нуклеиновой кислоты внутри большой бороздки дуплекса (рисунок). Триплексные мотивы, которые используют переход от дуплекса к триплексу, были включены в структуры, разработанные для динамических и / или структурных приложений (25), в то время как специфичное для последовательности распознавание ДНК образующими триплекс олигонуклеотидами использовалось для целевого введения не Компоненты нуклеиновой кислоты в каркасе ДНК (26).Здесь мы рассматриваем свойства триплексов, которые оказались полезными для создания наноструктур ДНК, с акцентом на приложения, которые до сих пор были невозможны только с помощью образования дуплексов.

Параллельная тройная спираль: ( A ) ЯМР-структура параллельного триплекса, образованного связыванием третьей цепи внутри большой бороздки дуплекса полипурин-полипиримдин (код PDB: 13DX). ( B ) Химические структуры параллельных триплетов T-AT и C ⁺ -GC.Обозначение X-RY относится к триплету, в котором основание третьей цепи (X) связывается с парой оснований пурина (R) и пиримидина (Y) его дуплекса-мишени. ( C ) Последовательность типичного 13-мерного триплекса, который мы использовали в нашей собственной работе, также показана в зигзагообразном формате. Третья цепь (X-цепь) показана темно-синим цветом, а дуплексные цепи олигопурина (R-цепь) и олигопиримидина (Y-цепь) — оранжевым и серым, соответственно. По возможности зигзагообразные диаграммы, цвета нитей и метки X, R и Y остаются неизменными по всему тексту.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, СТРУКТУРА И ТРЕБОВАНИЯ К СБОРКЕ ТРИПЛЕКСОВ

Триплексы нуклеиновых кислот были впервые экспериментально обнаружены 60 лет назад Ричем и его сотрудниками при смешивании полирибонуклеотидов polyU и polyA в соотношении 2: 1 (27). Группа Франк-Каменецкого позже показала, что зеркальный повтор гомопурин-гомопиримидин в сверхспиральной плазмиде способен образовывать внутримолекулярный триплекс в условиях низкого pH (28,29), что указывает на физиологическую роль этих комплексов в регуляции генов, а также на причину нестабильности генома (30).Примерно в это же время лаборатории Dervan и Hélène поняли, что образование межмолекулярного триплекса синтетическим олигонуклеотидом (31,32) может предоставить средства нацеливания на уникальные геномные последовательности и позволить модуляцию определенных генов (33). Однако с тех пор, как эти основополагающие исследования получили ограниченные доказательства образования триплексов в геномной ДНК, и интерес к их использованию для нацеливания на гены уменьшился, возможно, из-за растущего успеха других методологий нацеливания на гены, таких как цинковый палец. нуклеазы (ZFN) и эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN).Тем не менее, эта работа по счастливой случайности заложила основу для применения триплексов в ДНК-нанотехнологиях.

Образование триплекса может происходить практически в любой данной дуплексной последовательности олигопурин-олигопиримидин, и такие последовательности могут присутствовать или легко встраиваться в наноструктуру ДНК с незначительным влиянием на ее общую топологию. Связывание третьей цепи асимметрично внутри большой бороздки, при этом основания третьей цепи образуют Hoogsteen или обратные Hoogsteen водородные связи с «центральной» олигопурин-содержащей цепью целевого дуплекса (рисунок).Пиримидин-содержащие цепи связываются в параллельной ориентации относительно центральной цепи, при этом тимин и протонированный цитозин распознают пары оснований AT и GC, образуя триплеты оснований T-AT и C ⁺ -GC, соответственно (рисунок) (v). Цепи, содержащие пурин, связываются в антипараллельной ориентации, при этом аденин и гуанин узнают пары оснований AT и GC, образуя триплеты оснований A-AT и G-GC, соответственно (34,35). Обозначение X-RY, используемое здесь, относится к триплету, в котором третья цепь основания X взаимодействует с парой оснований дуплекса RY, образуя водородные связи с основанием R.Также возможно образование триплекса на мишенях со смешанными последовательностями (т.е. с последовательностями олигопурина, содержащими пиримидиновые прерывания) с использованием третьих цепей, содержащих основания или аналоги нуклеозидов (36,37). Триплексы могут быть образованы внутримолекулярно, посредством ассоциации одноцепочечной области того же дуплекса, которая сворачивается обратно на себя, или межмолекулярно, посредством ассоциации образующего триплекс олигонуклеотида (TFO) или последовательности (TFS) с отдельным дуплексом. Важно отметить, что внутримолекулярные и межмолекулярные мотивы совместимы с дуплексными областями, собранными с помощью перекрестного обмена цепей и обсуждаются в более позднем разделе.

Как параллельные, так и антипараллельные мотивы могут использоваться в дизайне наноструктур ДНК, но на практике параллельный мотив получил более широкое распространение по следующим причинам: во-первых, параллельные триплексы более стабильны, чем их антипараллельные аналоги, так как T-AT и Образованные в этом мотиве триплеты C ⁺ -GC структурно изоморфны; то есть, если атомы C-1 ‘их пар оснований W – C накладываются друг на друга, положения атомов C-1’ третьей цепи почти идентичны.Это сводит к минимуму искажение основной цепи как третьей цепи, так и дуплекса между соседними триплетами, что приводит лишь к небольшому возмущению лежащей в основе дуплексной структуры. Структуры ЯМР предполагают лишь небольшое расширение основной бороздки при образовании триплекса, что приводит к спирали, которая немного больше A, чем B-подобная (38,39). Как следствие, третьи цепи, состоящие из рибонуклеотидов или других нуклеотидов, которые содержат сахарную складку N-типа, немного более стабильны, чем их дезоксинуклеотидные эквиваленты.Во-вторых, образование параллельного мотива зависит от условий низкого pH (pH <6,0), необходимых для иминопротонирования положения N3 цитозина и образования второй водородной связи с положением N7 гуанина (рисунок). Хотя это может показаться ограничением, присутствие положительного заряда увеличивает стабильность триплекса, экранируя отталкивание заряда между тремя полианионными цепями (40). Однако ряды смежных остатков цитозина дестабилизируют из-за электростатического отталкивания между остатками (41).Таким образом, наиболее стабильные триплексы состоят из областей, содержащих разделенные триплеты C ⁺ -GC и T-AT, и пример последовательности, часто используемой в нашей собственной работе, показан на рисунке. Важно отметить, что зависимость параллельного мотива от pH также является полезным свойством, которое можно использовать для точной настройки связывания и / или удаления третьей цепи путем регулирования pH раствора, чаще всего между pH от 5,0 до 7,0, соответственно. В общем, нижележащие дуплексные области в наноструктуре гораздо меньше подвержены влиянию этого изменения pH.Эта зависимость от pH также может быть скорректирована или устранена с помощью различных имитаторов цитозина, которые обеспечивают стабильное образование триплекса при различных значениях pH (37). В-третьих, и, наконец, антипараллельный мотив требует использования G-богатых олигонуклеотидов, и ему мешает тенденция таких богатых пуринами цепей принимать другие неканонические структуры, такие как G-квадруплексы и GA-дуплексы, которые конкурируют с триплексами. формирование. Следовательно, исследования, описанные в оставшейся части этой статьи, касаются исключительно триплексов, генерируемых посредством параллельного мотива связывания с использованием богатых пиримидином третьих цепей.

В условиях низкого pH стабильность параллельного триплекса может быть выше, чем его нижележащий дуплекс, т.е. сродство третьей цепи к его целевому дуплексу больше, чем сродство дуплекса к его W – C партнеру (42). Например, температура плавления ( T _м ), определенная для диссоциации 13-мерной третьей цепи, показанной на рисунке, составляет 65 ° C, в то время как T _m для нижележащего дуплекса составляет 62 ° C (эксперименты проводится при pH 5.0 трис-ацетатный буфер, содержащий 15 мМ ацетата магния; неопубликованное наблюдение). Селективность образования триплекса также аналогична селективности дуплекса W – C; несоответствие одиночных оснований между третьей цепью и дуплексом приводит к типичному изменению свободной энергии примерно на 3 ккал / моль ^-1 (43-46). Степень дестабилизации зависит от природы и положения несоответствия, а центральные несоответствия дестабилизируют больше, чем терминальные, поскольку они нарушают кооперативное взаимодействие между соседними триплетами (44,46).Тем не менее, образование триплекса все еще возможно при несовпадении в третьей цепи (например, путем образования триплетов G-TA и T-CG), а также возможно создание триплексов с несовпадающими парами оснований в дуплексе (47). Сродство третьей цепи можно регулировать, изменяя ее длину, путем включения стабилизирующих аналогов нуклеозидов (37), путем добавления (48) или конъюгирования лигандов, стабилизирующих триплекс, с третьей цепью (49), а также с другими мульти- цепных структур, за счет увеличения концентрации противоионов, из которых Mg ²⁺ является наиболее эффективным для стабилизации параллельных триплексов (50).Следовательно, существует значительный набор последовательностей дуплекса и третьей цепи, которые могут быть введены в наноструктуры ДНК в зависимости от предполагаемого применения.

Наконец, кинетика образования триплекса значительно отличается от их дуплексных аналогов. Скорость образования триплекса примерно на три порядка ниже, чем образование дуплекса с сообщенными константами скорости ассоциации ~ . 10 ³ M ⁻¹ с ⁻¹ (41,44,51–53).Считается, что связывание третьей цепи происходит с через по механизму зародышеобразования-застежки-молнии, зависящему от образования квазистабильного промежуточного продукта, состоящего из нескольких продуктивных триплетов, перед «застегиванием» оставшейся части цепи вокруг дуплекса ( 44). Таким образом, кажущаяся скорость ассоциации уменьшается с температурой, поскольку более низкие температуры стабилизируют этот переходный промежуточный продукт (41,44,51). Например, было показано, что снижение температуры на 10 ° C приводит примерно к 2-кратному увеличению скорости ассоциации TFO (51).Хотя такая медленная кинетика ассоциации может показаться ограничением, это полезное свойство, которое можно использовать для сборки «одного горшка» наноструктур на основе триплекса, поскольку оно позволяет дуплексным областям в структуре сначала формироваться до связывания третья прядь, тем самым уменьшая ее влияние на процесс отжига. Скорость триплексной диссоциации также низкая, с сообщениями, предполагающими период полураспада от 30 минут до нескольких дней (41,44,51), и ее можно увеличить с помощью стабилизирующих аналогов нуклеозидов (52,53).

РЕКОНФИГУРИРУЕМЫЕ СТРУКТУРЫ НА ОСНОВЕ ДУПЛЕКСНО-ТРИПЛЕКСНОГО ПЕРЕХОДА

Одной из основных целей нанотехнологии ДНК является создание переключаемых структур, способных со временем занимать два или более различных структурных состояния (1,54). Первое устройство на основе дуплекса, которое обладало такими качествами, использовало структурный переход правой B-ДНК в левую Z-ДНК, вызванный добавлением хлорида гексамминкобальта (III) в раствор образца (55). Вскоре после этого это было распространено на пару «молекулярных пинцетов», которые можно было перенастроить с помощью реакции замещения цепи; надежный процесс, с помощью которого две цепи с частичной или полной комплементарностью гибридизуются друг с другом, смещая одну или несколько предварительно гибридизированных цепей в процессе (56).Подобные стратегии были использованы для разработки устройств на основе триплекса, которые используют обратимость перехода дуплекс-триплекс, либо путем изменения pH, использования лигандов, стабилизирующих триплекс, либо посредством процесса замещения цепи. Такие устройства были разработаны для определения pH раствора, для управления химическими реакциями, для захвата и / или высвобождения субстратов, для схем замещения цепей, а также для помощи в иерархической сборке и / или диссоциации протяженных структур ДНК и гетерогенных комплексов.

Для определения pH раствора

Большинство устройств на основе триплекса используют зависимость от pH параллельного образования триплекса с богатыми пиримидином олигонуклеотидами (57,58). Обычно в качестве входящего «топлива» в этих системах используются ионы H ⁺ и OH ^—, вводимые путем добавления HCl или NaOH к раствору образца. В отличие от устройств, основанных на смещении дуплексных цепей, которые генерируют дуплексы как так называемые «отходы», продуктами реакции являются просто H ₂ O и NaCl.Кроме того, не ожидается, что постепенное увеличение ионной силы из-за накопления соли изменит электростатический потенциал структуры ДНК и, следовательно, ее характеристики, пока соль не достигнет молярной концентрации. Более того, скорость диффузии ионов (миллисекунды) намного выше, чем у олигонуклеотидов (секунд), используемых для реакций замещения цепи, и, следовательно, позволяет сократить время цикла между состояниями.

О первой демонстрации устройства ДНК, использующего эту зависимость от pH, сообщили Мао и его коллеги чуть более 10 лет назад (57).Их устройство было основано на молекулярном пинцете, впервые описанном Yurke et al. (56). Устройство состоит из трех олигонуклеотидных цепей и работает за счет обратимого образования и диссоциации внутримолекулярного триплекса, генерируемого внутри устройства (Рисунок A (i)). При pH 8,0 три цепи образуют «открытый» комплекс, состоящий из трех дуплексов и одноцепочечной последовательности, образующей триплекс, которая принимает конформацию случайного клубка. При понижении pH до 5,0 одноцепочечный участок складывается вместе с соседним дуплексом, образуя триплекс, что приводит к более компактной «замкнутой» структуре.Структурное изменение было продемонстрировано сравнением подвижности двух комплексов неденатурирующим гель-электрофорезом и включением флуоресцентных красителей в систему. В флуоресцентных экспериментах два pH-независимых красителя были прикреплены к противоположным дуплексам, так что в открытом состоянии красители находились далеко друг от друга и не были способны к резонансной передаче энергии флуоресценции (FRET). Напротив, в закрытом состоянии два красителя находились в непосредственной близости, и можно было отслеживать сигнал флуоресценции (рисунок A (i)).Эксперименты показали, что конформационные изменения произошли за секунды, но эффективность циклирования ухудшилась в течение 16 циклов (рис. A (ii)). Было высказано предположение, что это уменьшение произошло из-за фотообесцвечивания флуоресцентных красителей или как следствие разбавления объема образца добавлением кислоты или основания, что снизило эффективную концентрацию и сигнал комплексов.

Устройства на основе триплекса, реагирующие на изменение pH: ( A ) (i) pH-зависимое устройство на основе молекулярного пинцета.Комплекс содержит правильно расположенную пару FRET (F1 и F2), которая позволяет контролировать открытие и закрытие устройства при изменении pH; (ii) данные FRET, полученные в результате повторного цикла pH такого устройства. Адаптировано из (57) с разрешения. ( B ) (i) pH-зависимое устройство на основе простого внутримолекулярного триплекса. Комплекс содержит правильно расположенный флуорофор (F) и гаситель (Q), который позволяет контролировать открытие и закрытие устройства при изменении pH.(ii) Изменение относительного содержания T-AT и C ⁺ -GC в таком устройстве позволяет определять различные значения pH. Адаптировано из (60) с разрешения. ( C ) (i) pH-зависимый комплекс, состоящий из внутримолекулярного триплекса и оксида графена (GO), используемый для мониторинга изменений pH, связанных с апоптозом в живых клетках. При высоком pH последовательность, образующая триплекс, взаимодействует с GO, в то время как при низком pH образование триплекса предотвращает это взаимодействие. Поскольку ГО гасит флуоресценцию, флуорофор, присоединенный к триплексу, позволяет напрямую контролировать ассоциацию и, следовательно, pH раствора.(ii) Флуоресцентные изображения живых клеток, трансфицированных с помощью GO-устройства. Адаптировано из (61) с разрешения.

Позже лаборатория Самори разработала еще одно устройство, основанное на гораздо более простой архитектуре, но аналогичном стиле работы (58). Устройство состоит из двух частично комплементарных цепей ДНК с одноцепочечной областью, способной образовывать внутримолекулярный триплекс с прилегающей областью дуплекса из-за наличия неструктурированной 5-нуклеотидной петли (рисунок B (i)).В дополнение к измерениям на основе FRET и гель-электрофореза система характеризовалась ультрафиолетовым (УФ) плавлением и круговым дихроизмом (CD). При низком pH последний приводил к спектру с отрицательным пиком около 215 нм, указывающим на образование триплекса. Используя модель статистики полимера, было подсчитано, что положение двух концов в триплексе различается на ~ 6 нм в течение каждого цикла. Изменение pH раствора позволяло устройству циклически переключаться между двумя состояниями без ухудшения с течением времени, причем циклы выполнялись с интервалом в миллисекунды.Однако позже было обнаружено, что ожидаемая эффективность FRET никогда не превышала 90%, что позволяет предположить, что количество устройств, которые были закрыты в растворе, было меньше, чем ожидалось (59). Это было связано с межмолекулярными взаимодействиями между устройствами, но было преодолено при низких концентрациях олигонуклеотидов (пикомолярных) путем привязки устройства к твердой подложке.

Одним из недостатков использования таких устройств в качестве датчиков pH является то, что они ограничены измерением в коротком диапазоне, обычно между 1.5 и 2,0 единицы pH. Чтобы преодолеть эту проблему, группа Риччи воспользовалась простым представлением о том, что окно pH для перехода от дуплекса к триплексу будет зависеть от относительного содержания C ⁺ -GC и T-AT в триплексе (60). Например, размыкание переключателя, содержащего в основном триплеты T-AT, будет запускаться при более основном pH (9,0–11,0) из-за депротонирования тимина (p K _a ∼ 10). Напротив, размыкание переключателя, содержащего в основном триплеты C ⁺ -GC, будет происходить при более кислом pH (5.0–7.0) из-за депротонирования цитозина (p K _a ∼ 5) (Рисунок B (ii)). Используя простую внутримолекулярную систему, описанную выше (58), авторы продемонстрировали, что диапазон 5,5 единиц pH может быть измерен с помощью двух или более переключателей в растворе, каждый из которых запускается в другом диапазоне pH. Авторы предположили, что такие устройства могут быть полезны для определения клеточных экстрактов в реальном времени, в in vivo клетках или в других средах, где изменения pH представляют собой важный вклад как в здоровые, так и в патологические биологические пути.Действительно, сенсор на основе триплекса, основанный на вышеупомянутой конструкции, использовался для мониторинга изменений pH, связанных с апоптозом в живых клетках, чтобы помочь в диагностике рака (61). Это было достигнуто за счет использования того факта, что одноцепочечные области молекулы ДНК могут связываться с оксидом графена (GO), тогда как дуплексные или триплексные области — нет. Сенсор состоит из двухцепочечной шпильки с триплекс-образующей на хвосте последовательностью, которая при pH 8,0 способна взаимодействовать с GO, в то время как при pH 5,0 образование триплекса предотвращает это взаимодействие (рис. C (i)).Поскольку GO способен гасить флуоресценцию, прикрепление флуоресцентного красителя к одной из дуплексных цепей сенсора позволяет отслеживать переход от дуплекса к триплексу по изменению интенсивности флуоресценции. Авторы предварительно сформировали комплекс при pH 8,0 перед трансфекцией в клетки Ramos (лимфомы) и продемонстрировали успешную транслокацию через клеточную мембрану. Добавление сульфата винкристина к клеткам, которое вызывает апоптоз и внутриклеточное закисление, привело к образованию триплекса внутри устройства и его высвобождению из ГО.Затем наблюдали увеличение сигнала флуоресценции, которое локализовали с помощью конфокальной микроскопии (рис. C (ii)).

Для управления химическими реакциями

Переходы из дуплекса в триплекс также использовались для управления специфическими химическими реакциями с триплексной структурой. Это было впервые элегантно продемонстрировано Мао и его коллегами, которые использовали систему, которая использует это конформационное изменение для прямого образования амидной связи (ацилирование амина) между группой карбоновой кислоты и одним из двух идентичных аминов, расположенных на разных цепях внутри устройства (рисунок) (62). ).В присутствии агента конденсации реакция была направлена ​​на один из двух аминов за счет ассоциации и диссоциации третьей цепи из-за изменения pH раствора. Более того, эффективность реакции была высокой, с выходами 88% и 67% для реакций при pH 8,0 (реакция 1) и pH 5,0 (реакция 2), соответственно (рисунок). Такой подход может быть полезен в синтетической химии, где стратегии снятия защиты сложны или дороги. Действительно, аналогичное устройство на основе триплекса было интегрировано в микрожидкостный чип, что позволило электронным способом управлять локальным циклическим изменением и переключением pH и, следовательно, реакциями внутри устройства (63).Авторы продемонстрировали быстрый контроль над реакцией лигирования ДНК между дисульфидными связями внутри триплексных комплексов и предлагают более широкое применение устройства в биотехнологии, вычислениях ДНК и контроле самосборки.

Химические реакции, направленные на триплекс: ( A ) Направление образования амидной связи путем образования триплекса. Группа карбоновой кислоты, присоединенная к последовательности, образующей триплекс, расположена рядом с концевым (амин 1) или центральным амином (амин 2) при образовании дуплекса и триплекса, соответственно.Реакция инициируется добавлением конденсирующего агента. Адаптировано из (62) с разрешения. ( B ) Контроль реакций алкиноазидного циклоприсоединения, катализируемых медью. (i) При образовании дуплекса реакция приводит к связыванию двух цепей дуплекса (реакция 1). (ii) Последующее добавление триплексного связующего, которое способствует образованию триплекса, приводит к связыванию третьей цепи с предварительно связанным дуплексом (реакция 2). Адаптировано из (64) с разрешения.

Также возможно управлять переходами из дуплекса в триплекс, используя небольшие молекулы, которые избирательно стабилизируют триплекс по сравнению с дуплексной ДНК.Такие небольшие молекулы обычно состоят из ароматических колец для укладки между триплетами оснований и могут также включать положительный заряд для частичного уменьшения отталкивания зарядов между тремя полианионными цепями (48). Готельф и его сотрудники были первыми, кто продемонстрировал такой контроль над двойной катализируемой медью реакцией алкин-азидного циклоприсоединения CuAAC («щелчок»), используя такую ​​стратегию (рисунок) (64). Их система состояла из межмолекулярного триплекса, который содержал азиды как на X-, так и на R-цепи, и двойную алкиновую модификацию на Y-цепи.В отсутствие лиганда реакция между R- и Y-цепями будет протекать (т.е. между дуплексными цепями) с образованием триазольной связи между азидом на R-цепи и одним из двух алкинов, расположенных на Y-цепи. После добавления лиганда, который способствовал образованию триплекса, вторая триазольная связь образовывалась между азидом на третьей цепи и непрореагировавшим вторым из двух алкинов, расположенных на Y-цепи. Таким образом, продукт реакции представляет собой продукт с двойной связью, соединяющий три олигонуклеотида.Выход реакции составил 90% и 80% для дуплексной и триплексной систем соответственно. Авторы предполагают, что скорость направленной на триплекс реакции может контролироваться с помощью различных стабилизирующих триплекс лигандов, каждый из которых имеет разную аффинность связывания с триплексом. Например, скорость реакции можно увеличить, добавив сильное триплексное связующее, такое как нафтилхинолин, или замедлить, добавив более слабое связующее, например коралин. Интересно, что авторы предполагают, что продукт их реакции; трехсторонняя разветвленная структура сама может быть использована в качестве основы для новых архитектур ДНК.

Для захвата и / или высвобождения субстратов

Возможность переключения между дуплексным и триплексным состояниями использовалась для открытия и закрытия структур ДНК различных архитектур и предлагает возможность захватывать, инкапсулировать и / или высвобождать различные субстраты. Впервые это было продемонстрировано Deng et al. , который разработал пару молекулярных пинцетов, содержащих область, образующую триплекс, которая позволяет захватывать ДНК-мишень (рисунок) (65). Пинцет был основан на молекуле с двойным кроссовером (DX), впервые описанной лабораторией Seeman с «закрытым» устройством, содержащим захваченную цель, разработанным для имитации полностью сформированной DX-структуры (например.грамм. Фигура ). «Открытое» устройство сначала было собрано из четырех олигонуклеотидных цепей; две цепи без кроссовера, которые увеличивают длину каждой спирали, и две цепи, которые удерживают молекулу вместе, образуя единый кроссовер только на одной стороне молекулы. Введение цепи-мишени при pH 5,0 затем приводило к ее связыванию путем образования триплекса со специфическими дуплексными областями, собранными в центре молекулы. Затем использовали набор ДНК (или запирающуюся цепь) для захвата цепи путем закрытия пинцета посредством образования одноцепочечного второго кроссовера на другой стороне молекулы.Затем pH был переключен на 5,7, и при этом увеличенном pH пинцет все еще надежно удерживал цель через закрывающее действие и некоторое оставшееся связывание Хугстина с целью. Нить запирающего устройства содержала одноцепочечную опору, которую можно было использовать для высвобождения ДНК-мишени посредством смещения цепи и раскрытия молекулы. Поскольку устройство основано на молекуле DX (3), оно предлагает интригующую возможность его взаимодействия с 2D DX-массивом (например, рисунок) (14). Это может не только использоваться для визуализации его действия, но и может вызывать движение молекул внутри структуры.

Устройства на основе триплекса, способные улавливать и выделять молекулы: ( A ) Управление устройством DX, похожим на пинцет, которое захватывает / выделяет одноцепочечную ДНК. Захваченная цепь связывается посредством образования триплекса и впоследствии удерживается на месте путем добавления цепочки, удерживающей палец, которая образует второй кроссовер молекулы. При увеличении pH олигонуклеотид остается захваченным и высвобождается только при удалении цепи, содержащей удерживающий палец, путем добавления его комплемента W – C.Адаптировано из (65) с разрешения. ( B ) Контроль устройства типа зажима, которое обнаруживает АТФ. Триплекс, образованный внутри молекулы путем добавления ее R-цепи, сближает две половины расщепленного аптамера, способного связывать АТФ. Адаптировано из (67) с разрешения.

Более простая структура, разработанная Риччи и соавторами, представляла собой зажим в виде зонда, который работал путем образования межмолекулярного триплекса с целевой молекулой, представляющей собой однонитевую ДНК (66). Зажим состоял из двух распознающих элементов, разделенных неструктурированной петлей из 10 нуклеотидов.Первым элементом распознавания была полипиримидиновая последовательность, предназначенная для связывания с одноцепочечной целевой последовательностью полипурина путем спаривания оснований W – C, тогда как вторым была последовательность полипиримидина, которая связала этот дуплекс за счет спаривания оснований Хугстина. Образование этой триплексной конформации привело к замыканию переключателя. По сравнению с простым взаимодействием двух цепей дуплекса W – C включение третьей цепи увеличивало не только сродство зонда, но также улучшало его эффективность распознавания в отношении несоответствия пары оснований на 1.2 ± 0,2 ккал моль ^-1 . С тех пор авторы использовали такой зажим как средство регуляции различных чувствительных к мишени аптамеров нуклеиновых кислот, разработанных для обнаружения либо аденозинтрифосфата (АТФ), либо кокаина, либо гентамицина; антибиотик, используемый для лечения различных бактериальных инфекций (рисунок) (67). Каждый из аптамеров был разделен на два сегмента (расщепленные аптамеры), причем один сегмент был связан с одним концом зажимающего олигонуклеотида, а другой сегмент — с другим концом олигонуклеотида.В отсутствие образования триплекса две половины находятся далеко друг от друга и не способны связывать свою целевую молекулу. Напротив, добавление центральной олигонуклеотидной цепи (активатора ДНК) генерировало триплекс и сближало две половины расщепленного аптамера, позволяя связываться с молекулой-мишенью. Чтобы контролировать этот процесс, расщепленный аптамер метили флуорофором и гасителем на каждом конце, что позволяло наблюдать за обнаружением мишени по изменению флуоресценции.Было показано, что эффективность, с которой нанопереключатель связывается с АТФ, может изменяться на 2–3 порядка (нМ — мкМ K _D ) простым изменением концентрации активатора ДНК и подчиняться модели простой аллостерической реакции. активация, часто наблюдаемая с биологическими молекулами, такими как белковые рецепторы. Более того, регулирование может быть дополнительно настроено путем удаления активатора ДНК путем изменения pH или смещения цепи, а также путем использования более чем одного активатора ДНК в тандеме.

Совсем недавно Willner et al. описали сборку микрокапсул на основе триплекса, способных высвобождать квантовые точки (КТ) CdSe / ZnS (68). Для сборки капсул микрочастицы CaCO ₃ сначала загружали квантовыми точками, а затем покрывали положительно заряженным полиэлектролитом гидрохолорида полиаллиламина (ПАУ). Это позволило послойно осаждать оболочку нуклеиновой кислоты посредством межмолекулярной гибридизации ряда цепей, предназначенных для взаимодействия посредством образования дуплексов W – C.Затем ядро ​​CaCO ₃ растворяли путем добавления этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), высвобождая инкапсулированные QD внутри капсулы. Важно отметить, что олигонуклеотиды, составляющие оболочку, были сконструированы таким образом, чтобы образовывать внутримолекулярные триплексы при понижении pH. Это, в свою очередь, нарушает их взаимодействие друг с другом и позволяет высвобождать квантовые точки. Сборку капсул и высвобождение квантовых точек контролировали по внутренней флуоресценции инкапсулированных квантовых точек, и авторы показали, что изменение относительного содержания T-AT и C ⁺ -GC позволяет высвобождать квантовые точки при различных значениях pH. .Размер микрокапсул был рассчитан как 3,5 ± 0,8 мкм и, вероятно, найдет применение при визуализации и других исследованиях, но, возможно, они слишком велики, чтобы обеспечивать доставку лекарств и белков в клетки.

Для реакций замещения цепи

Смещение дуплексной цепи часто инициируется в одноцепочечном домене («опоре»), комплементарном «вторгающемуся» олигонуклеотиду, и прогрессирует в процессе миграции ветвей. Реакция протекает, потому что больше пар оснований образуется в результате гибридизации цепи, содержащей опорный палец, с вторгающейся цепью, чем при связывании с ее исходным партнером.Простейший способ вытеснить третью цепь от ее дуплексного партнера достигается добавлением избытка ее комплемента W – C (например, рисунок A (i)). Стратегия, опосредованная пальцами ног, также возможна путем добавления одноцепочечного домена к концу третьей цепи (т. Е. Рисунок A (ii)). Первый является кинетически контролируемым и использовался для определения кинетики диссоциации при образовании триплекса (52,53,69), в то время как последний контролируется термодинамически и может регулироваться во многом так же, как это было продемонстрировано для реакций смещения дуплексных цепей, е.грамм. путем корректировки базовой последовательности и / или длины опоры (неопубликованное наблюдение). Важно отметить, что в обоих случаях структура и стабильность нижележащей дуплексной области в наноструктуре, скорее всего, останутся неизменными.

Триплекс-опосредованные реакции замещения цепи: ( A ) (i) Механизм замещения третьей цепи путем добавления ее комплемента W – C; (ii) добавление опорной стойки к концу третьей нити можно использовать для усиления реакции. ( B ) Механизм смещения дуплексной цепи с использованием короткого триплексного домена в качестве опоры.Связывание третьей цепи позиционирует цепь S2 рядом с идентичной цепью S и в результате приводит к ее постепенному вытеснению из дуплекса за счет миграции ветвей. Адаптировано из (70) с разрешения. ( C ) (i) OH ^— -активное смещение дуплексной цепи. При низком pH связывание третьей нити блокирует доступ вторгающейся нити к опоре дуплекса и предотвращает смещение нити, в то время как при высоком pH третья нить диссоциирует, и реакция замещения может продолжаться. (ii) Смещение дуплексной цепи, активируемое H ⁺ .При низком pH образование триплекса с зажимообразным олигонуклеотидом, содержащим как Y2-, так и X-цепи, приводит к вытеснению идентичной цепи Y. Адаптировано из (71) с разрешения.

Формирование триплекса также использовалось для направления смещения цепи дуплекса (т.е. удаления одной из двух цепей нижележащего дуплекса W – C) и было впервые продемонстрировано Mao и соавторами (рисунок) (70). В их системе дуплексная мишень состояла из цепочки-шаблона с областью шпильки на одном конце молекулы и более короткого комплемента W – C, предназначенного для связывания с оставшейся одноцепочечной областью, создавая непрерывный дуплекс с сайтом разрыва, где две пряди стыкуются.Для замещения более короткой цепи был разработан третий олигонуклеотид, который сначала связывается с областью шпильки молекулы путем образования триплекса, одновременно располагая в непосредственной близости от сегмента олигонуклеотида, идентичного по последовательности более короткой цепи. Следовательно, связывание третьей цепи приводит к вытеснению более короткой цепи из дуплекса. Первые два шага обратимы, но последний шаг по существу необратим, что приводит к общей реакции на завершение.Интересно, что авторы использовали этот подход для обнаружения временного образования цитозинсодержащего триплекса при нейтральном pH, что невозможно при использовании других методов. Это простая стратегия, которую можно дополнительно контролировать, регулируя pH и, следовательно, стабильность и кинетику образующейся триплексной области. Вслед за этим группа Риччи разработала два разных подхода, которые используют зависимость параллельных триплексов от pH в качестве средства активации или ингибирования реакций смещения дуплексных цепей на основе пальцев (рисунок) (71).В первом подходе использовалось образование триплекса при низком pH, чтобы физически предотвратить возникновение реакции замещения из-за стерических препятствий между связанным TFO и вторгающейся цепью (рис. C (i)). Во втором подходе использовалась захватывающая цепь, похожая на зажим, которая может инициировать смещение цепи напрямую, но только при образовании триплекса за счет снижения pH. Это было достигнуто путем ограничения длины Y-области цепи, чтобы она не приводила к образованию дуплекса в одиночку и требовала связывания третьей цепи в тандеме для образования стабильного комплекса (Рисунок C (ii)).Обе стратегии были продемонстрированы с использованием второго каскада, когда высвобожденная цепь разрушала дуплекс, содержащий флуорофор и гаситель, и, таким образом, приводила к увеличению сигнала флуоресценции. Поскольку стабильность триплекса можно регулировать при различных значениях pH, авторы предполагают, что постепенное ингибирование / активация процесса замещения цепи может быть достигнуто небольшими изменениями pH раствора.

Для иерархической сборки и / или диссоциации

Расширенные структуры ДНК

Риччи и его сотрудники использовали способность активировать или ингибировать смещение дуплексной цепи за счет образования триплекса в качестве средства контроля сборки конкатамеров ДНК, генерируемых посредством цепи гибридизации реакция (HCR) (72).HCR — это процесс, посредством которого две метастабильные дуплексные шпильки реагируют друг с другом в присутствии запускающей одиночной нити. Добавление инициатора открывает шпильку одного вида, обнажая новую одноцепочечную область, которая открывает шпильку второго вида. Это, в свою очередь, обнажает одноцепочечный участок, идентичный исходному инициатору. Результирующая цепная реакция приводит к образованию дуплекса с разрывом, который может расти до тех пор, пока запас шпильки не будет исчерпан. Группа адаптировала этот подход, переработав один из двух видов шпилек (HP1), чтобы включить хвост из девяти нуклеотидов, который при низком pH может образовывать триплекс с концевой частью дуплекса (рис. A (i)).Структура действует как молекулярная ловушка, изолирующая домен опоры, обнаруженный в одноцепочечной петле, соединяющей образующий триплекс хвост с шпилькой, и тем самым предотвращает связывание цепи инициатора и начало полимеризации. При увеличении pH третья цепь диссоциирует, и реакция HCR протекает со вторым видом шпильки (HP2), генерирующим конкатемер двух дуплексов шпильки (рис. A (ii)). Также использовалась вторая стратегия, которая позволяла активировать реакцию при кислом pH.В этом случае образующая триплекс последовательность, прикрепленная к шпильке, используется для стабилизации, а не предотвращения взаимодействия цепи инициатора с более короткой последовательностью опоры, которая в нормальных условиях недостаточно длинна, чтобы обеспечить зарождение инициатора и эффективную HCR. Та же группа также разработала схему смещения прядей на основе триплекса в качестве средства управления сборкой массивов плиток с двойным кроссовером (рисунок) (73). Цепь состоит из одноцепочечного катализатора, который связывается с pH-зависимым субстратом, что приводит к высвобождению нити депротектора (рис. B (i) и (ii)), которая, в свою очередь, активирует последующую реакцию самосборки, необратимо связывая с защищенной плиткой (Рисунок B (iii)).В результате получается реактивная плитка, которая собирается в решетки, подобные тем, что показаны на рисунке. PH-зависимый субстрат формируется с использованием цепочки, образующей триплекс, которая физически препятствует смещению цепей с катализатором до тех пор, пока pH раствора не увеличится и третья цепочка не диссоциирует (Рисунок B (i)). Авторы предполагают, что такие системы могут предложить лучший пространственно-временной контроль над процессами самосборки наноструктур на основе ДНК.

Иерархическое образование протяженных комплексов ДНК посредством контроля реакций замещения цепи.( A ) Образование конкатемера ДНК при щелочном pH. Система состоит из двух видов метастабильных шпилек, которые реагируют друг с другом в присутствии цепочки инициатора. Инициатор связывается с опорной областью шпильки одного вида (HP1) и посредством смещения цепи открывает новую одноцепочечную область, которая открывает шпильку второго вида (HP2), создавая конкатемер двух дуплексов. (i) При низком pH связывание инициатора с HP1 ингибируется из-за образования триплекса, который изолирует основную часть молекулы.(ii) Повышение pH приводит к диссоциации третьей цепи, что делает возможным связывание инициатора и последующую полимеризацию двух видов шпилек. Адаптировано из (72) с разрешения. ( B ) Образование решеток с двойным кроссовером при щелочном pH. Система состоит из схемы смещения нити на основе триплекса, которая активирует последующую реакцию самосборки: формирование массива DX, аналогичного по конструкции показанному на рисунке. (i) Цепь инициируется связыванием нити катализатора с pH-зависимым субстратом.При низком pH образование триплекса предотвращает это взаимодействие, тогда как при высоком pH реакция может продолжаться. (ii) Связывание с катализатором высвобождает цепь депротектора за счет смещения цепи. (ii) Нить депротектора затем связывается с защищенной плиткой, которая становится реактивной за счет смещения защитных цепей, покрывающих липкие концы молекулы, что приводит к образованию массива. Адаптировано из (73) с разрешения.

Используя другой подход, группа Виллнера продемонстрировала контролируемую циклическую сборку и разделение гексагональных оригами-димерных и тримерных систем на основе pH-зависимого перехода дуплекс-триплекс (74).Для этого край одной из плиток оригами (плитка 1) был сконструирован с привязкой нуклеиновой кислоты, которая при нейтральном pH состояла из CG-дуплекса и одноцепочечного выступа, способного связываться через W – C-пары с однониточный шнур, прикрепленный к другой плитке оригами (плитка 2) (рисунок). При понижении pH первый одноцепочечный домен плитки 1 предпочтительно образует внутримолекулярный триплекс и нарушает его ассоциацию с плиткой 2, разделяя комплекс оригами на составляющие его мономеры.Система была обратимо перенастроена путем увеличения pH до нейтральных условий, что позволило двум мономерам оригами снова объединиться. Вторая стратегия была также разработана на основе образования межмолекулярного триплекса, содержащего преимущественно триплеты Т-АТ, что позволило структуре циклически проходить через более высокие значения pH (pH 7,0–9,0), при этом плитки оригами диссоциируют при более высоких значениях pH. Затем обе стратегии были объединены для создания тримеров оригами, которые могут диссоциировать на два разных димера при соответствующем изменении pH: плитка 3 содержала одноцепочечные удлинения, которые комплементарны таковым в плитке 4, но складывались обратно, образуя внутримолекулярный C ⁺ -GC триплекс при pH 4.5, в то время как плитки 4 и 5 были соединены триплексным мостиком T-AT, который диссоциирует при pH 9,5. Таким образом, при изменении pH от 7,0 до 4,5 тример диссоциирует с образованием димера плиток 4–5, при изменении pH от 7,0 до 9,5 тример диссоциирует с образованием димера плиток 3–4. В обоих случаях тример можно собрать, вернув его к исходному pH 7,0.

Иерархическая сборка и / или диссоциация протяженных комплексов ДНК посредством изменения pH: ( A ) Триплексный мотив, используемый для реконфигурации взаимодействий гексагональных плиток оригами.При высоком pH нити образуют два взаимосвязанных дуплекса между плиткой 1 и плиткой 2, в то время как при низком pH одна нить одного из партнеров дуплекса складывается назад и образует внутримолекулярный триплекс, приводящий к диссоциации двух плиток. Адаптировано из (74) с разрешения. ( B ) Триплексный мотив, используемый для перенастройки взаимодействия мотива трехконечной звезды в тетраэдр ДНК, подобный показанному на рисунке. При низком pH два липких конца, модифицированных триплексом, взаимодействуют, а при высоком — нет.Адаптировано из (75) с разрешения.

Формирование триплекса также использовалось Мао и его коллегами для изотермической сборки и диссоциации тетраэдра ДНК в ответ на изменение pH (75). Тетраэдр был основан на ранее разработанной авторами структуре, которая собирается из четырех копий трехконечного звездного мотива посредством сцепления на липких концах (рисунок) (9). В этом случае однониточная последовательность, образующая триплекс, была введена рядом с липкими концами молекулы, которая была способна образовывать триплекс поперек спиралей отдельных мотивов (рисунок).В то время как липкие концы объединяют мотивы, чтобы управлять общей геометрией многогранника, они были спроектированы так, чтобы быть внутренне нестабильными в отсутствие последовательности формирования триплекса, которая обеспечивает дополнительную прочность сцепления при правильных условиях. При pH 5,0 тетраэдр образовывался из мотивов трехконечной звезды, и при увеличении pH он диссоциировал на составляющие мотивы. Процесс сборки / разборки также можно циклически повторять, изменяя pH. Это было интересное исследование, которое предлагает возможность инкапсулировать и / или запускать высвобождение молекулярного груза в зависимости от изменения pH.

Гетерогенные комплексы

Формирование триплекса также использовалось как средство для агрегации / диссоциации кластеров и сборок наночастиц (НЧ), в частности, состоящих из золота (AuNP) и наночастиц серебра (AgNP). Поскольку оптические и флуоресцентные свойства таких наночастиц зависят от расстояния между ними, возможность реконфигурировать их расположение (т.е. через изменение pH) дает возможность изучать и / или использовать эти свойства. Первая обратимая система была разработана лабораторией Чоя (76).Он состоял из двух наборов AuNP, модифицированных олигонуклеотидами; первый содержал олигонуклеотид, предназначенный для складывания в дуплекс шпильки, а второй содержал олигонуклеотид, способный связываться с этим дуплексом посредством образования триплекса при низком pH (рисунок). Поскольку процесс конъюгации тиолов приводит к присоединению нескольких олигонуклеотидов к одной золотой частице, образование триплекса между многими или всеми цепями привело к генерации протяженной трехмерной сети с более близкими друг к другу НЧ, чем когда они находятся в свободном состоянии в растворе.Успешная кластеризация комплексов наблюдалась по изменению цвета раствора образца с красного на красновато-пурпурный и характеризовалась просвечивающей электронной микроскопией (ПЭМ) (рисунок). Дальнейшие исследования были предприняты для улучшения контроля над средним разделением частиц в таких комплексах (77,78). Мао и др. также продемонстрировали специфическое расширение / сжатие агрегатов AuNP с использованием другой стратегии (79). Два набора AuNP были функционализированы олигонуклеотидами, которые связывались с образованием дуплекса на одном конце, оставляя фланкирующую одноцепочечную область на другом.Конструкция была такой, что одноцепочечная область могла складываться на дуплексе, образованном между частицами, и генерировать триплекс при низком pH. Циклическое изменение pH приводило к расширению и сжатию наночастиц, что наблюдалось как изменение пика плазмонного резонанса AuNP с 524 до 533 нм соответственно. Интересно, что различные группы использовали такие системы, как колориметрический анализ, для скрининга потенциальных триплекс-связывающих молекул (80,81). Такие агенты представляют интерес, поскольку их можно использовать для стабилизации предполагаемых триплексов, образованных в геномной ДНК, которые могут модулировать экспрессию определенных генов.

Иерархическая сборка / диссоциация гетерогенных комплексов: ( A ) pH-зависимая агрегация наночастиц золота. Один набор наночастиц золота функционализирован третьей цепью, в то время как второй набор функционализирован своим дуплексным партнером. Диссоциация / сборка двух наборов золотых частиц в трехмерную сеть контролируется изменением pH. Адаптировано из (76) с разрешения. ( B ) Агрегация однослойных углеродных нанотрубок, вызванная низкими молекулами.Каждая нанотрубка функционализирована одним или несколькими дуплексами polyT-polyA, способными к повторному разделению в триплекс polyT-polyA-polyT при добавлении стабилизирующего триплекс лиганда, такого как коралин. Адаптировано из (84) с разрешения; ( C ) pH-чувствительные гидрогели. Акриламидные цепи функционализированы одной цепью ДНК, способной образовывать либо межмолекулярный дуплекс при высоком pH, либо внутримолекулярный триплекс при низком pH, что приводит к ассоциации и диссоциации цепей сополимера, соответственно.Адаптировано из (85) с разрешения.

Другой подход к направленной сборке кластеров НЧ был продемонстрирован Qu и соавторами (82), которые использовали наблюдение, что ион серебра (Ag (I)) может специфически замещать протон N3 цитозина внутри C Триплет ⁺ -GC, устраняющий его зависимость от pH (83). Вдохновленные этой уникальной особенностью, они продемонстрировали образование гомогенных кластеров Ag ² путем восстановления ионов Ag (I), присутствующих в определенном участке C-GC в триплексе, с помощью химии Толленса.Более того, это было распространено на несколько мест в структуре за счет включения нескольких триплетов C-GC. Авторы предполагают, что поскольку флуоресцентные свойства Ag ² отличаются от Ag, этот подход может быть полезен для управляемого матрицей синтеза флуоресцентных кластеров Ag ² .

Формирование триплекса также использовалось при самосборке однослойных углеродных нанотрубок (ОСУНТ) за счет использования лигандов, стабилизирующих триплекс (84). Один набор SWCNT был помечен одноцепочечным polyT, тогда как другой набор был помечен polyA.В присутствии коралина-индуктора триплекса дуплекс dT22-dA22 индуцировался с образованием триплекса dT22-dA22-dT22, что приводило к агрегации SWCNTs (рисунок). Эта агрегация происходит только в присутствии триплекс-индуктора и, таким образом, может использоваться при создании многофункциональных архитектур для электрических и биосенсорных приложений. Наконец, Willner et al. недавно применили формирование триплекса для приготовления рН-чувствительных гидрогелей ДНК (85). В одной из их систем двойные спирали использовались в качестве мостиков между акриламидными цепями, которые образовывали акриламидный гель (рисунок).Конструкция дуплексных областей была такой, что при понижении pH дуплексные единицы будут генерировать внутримолекулярные триплексы, тем самым предотвращая их ассоциацию, и приводили к растворению геля в его жидкой фазе. В другой системе акриламидные цепи удерживались вместе за счет межмолекулярной ассоциации триплекса, состоящего преимущественно из триплетов Т-АТ. На этот раз растворение геля происходило при pH 10,0 из-за разделения триплексных мостиковых звеньев при депротонировании тимина.Авторы продемонстрировали, что обе системы гидрогеля могут претерпевать обратимые и циклические переходы гидрогель / раствор, подвергая системы подходящим значениям pH. Кроме того, стабилизирующий триплекс лиганд коралин может быть использован в гидрогеле для увеличения его жесткости. Объединив обе системы, авторы также продемонстрировали создание гидрогелей ДНК с памятью формы, способных изменять свое состояние в зависимости от изменения pH (86).

ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫЕ СТРУКТУРЫ, ОСНОВАННЫЕ НА АДРЕСАЦИИ ТРИПЛЕКСНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Многие из предложенных приложений, которые обсуждались для наноструктур ДНК, сначала потребуют прикрепления биологических и / или химических компонентов к точным областям вдоль каркаса ДНК.Например, включение белка в структуру будет придавать такие свойства, как молекулярное распознавание (например, антитела), каталитический оборот (например, ферменты) и / или преобразование энергии (например, фотосинтетические белки). Кроме того, он предоставляет средства для характеристики таких молекул с помощью различных методов визуализации и структурного анализа. Метод, наиболее часто используемый для включения таких компонентов, основан на их присоединении к одной или нескольким олигонуклеотидным цепям, составляющих часть самой наноструктуры, или, где это применимо, их привлечении к реактивной группе, включенной таким же образом (14).Однако многие компоненты или реакционноспособные группы не выдерживают высоких температур и медленных стадий отжига, необходимых для сборки структуры, и нежелательные побочные взаимодействия могут также нарушить путь сворачивания и / или снизить стабильность лежащего в основе комплекса. Кроме того, компоненты обычно присоединяются к концу олигонуклеотида, поскольку введение внутренних модификаций синтетически более утомительно, а включение нескольких реакционноспособных групп в один и тот же олигонуклеотид может привести к перекрестной реактивности во время стадии конъюгации (например,грамм. тиолы). Это не только ограничивает расположение и количество компонентов, которые могут быть введены, но также ограничивает способность лигировать концы олигонуклеотидов, что было использовано для улучшения структурной целостности наноструктуры (87). Один из подходов, используемых для решения этих проблем, состоит в том, чтобы ввести однонитевые выступы, которые выступают за поверхность наноструктуры или над ней. Конъюгация компонента с олигонуклеотидом, предназначенным для гибридизации с этими областями, может использоваться для нацеливания на структуру после процесса сборки (88).Но это опять же ограничено необходимостью расположения выступов на концах олигонуклеотидов и неприменимо к наноструктурам, которые демонстрируют ковалентно замкнутые топологии. Более полезной стратегией является использование адресуемости последовательностей двухспиральных областей наноструктуры с использованием программируемого агента распознавания ДНК, такого как триплексообразующие олигонуклеотиды (26). Присоединение компонента или реактивной группы к концу TFO затем приведет к его целенаправленному введению в последовательности, которые либо присутствуют, либо встроены в наноструктуру через дизайн.Основным преимуществом использования TFO по сравнению с другими агентами распознавания ДНК является их совместимость с различными стратегиями конъюгации, разработанными для присоединения компонентов к олигонуклеотиду, такими как ковалентная медь и стратегии «щелчка» без меди, а также малеимид и аминохимия. как нековалентные взаимодействия NTA: His-Tag и биотин: стрептавидин, и это лишь некоторые из них. Более того, связывание и / или удаление TFO можно контролировать аналогично устройствам, описанным выше (то есть изменением pH, триплекс-стабилизирующими лигандами, смещением цепи и т. Д.). Следовательно, триплексный подход к распознаванию ДНК использовался для создания каркаса компонентов в 2D и 3D, а также как средство для управления позиционированием молекул, которые могут химически модифицировать лежащую в основе ДНК.

Для каркаса компонентов, не являющихся нуклеиновыми кислотами

Первоначальной мотивацией для создания объектов и решеток из ДНК было использование этих структур в качестве каркасов для пространственной организации молекул ненуклеиновых кислот в 2D и 3D пространстве (89). Такие гетерогенные комплексы могут быть использованы для изучения структуры и взаимодействий присоединенных молекул, для манипулирования биологическими или химическими каскадами, для создания оптических и электронных устройств, а также для создания наноразмерных рисунков и литографических приложений.

Композиции в 2D

Группы Нордена и Брауна были первыми, кто исследовал связывание TFO со специфической двойной спиральной областью в наноструктуре ДНК (90). Структура состояла из двух соседних гексагональных единиц (аналогичных нафталину), собранных из десяти уникальных трехсторонних разветвленных олигонуклеотидов, и в принципе каждый из одиннадцати 10-мерных двухспиральных ребер мог быть адресован различным TFO (рисунок). Авторы предполагают, что такое устройство можно использовать для хранения информации с чрезвычайно плотным информационным содержанием, поскольку его общая площадь составляет всего 10 × 20 нм ² .Связывание с одним из спиральных краев было продемонстрировано FRET между красителем, расположенным на концах TFO (F1), и вторым красителем, расположенным на нижележащей наноструктуре (F2), и, как и ожидалось, его можно было обратить, регулируя pH раствора. Циклирование достигалось при значениях pH выше, чем описано выше, между значениями pH от 6,3 до 7,5, поскольку TFO состоит из стабилизирующих аналогов нуклеозидов 2′-аминоэтокси-T и 2′-аминотокси-2-аминопиридина, которые обеспечивают улучшенные распознавание пар оснований AT и GC соответственно (37).

Триплекс-направленное нацеливание на наноструктуры ДНК: Триплексная адресация последовательностей различных архитектур ДНК. ( A ) Нацеливание на индивидуальную последовательность в гексагональном массиве, созданном из разветвленных трехкомпонентных олигонуклеотидов. Комплекс содержит правильно расположенную пару FRET (F1 и F2), которая позволяет контролировать ассоциацию и диссоциацию TFO по изменению pH. Адаптировано из (90) с разрешения. ( B ) Триплекс-направленный каркас из плитки и массива с двойным кроссовером со стрептавидиновыми белками.Адаптировано из (91) с разрешения. ( C ) Нацеливание на отдельную последовательность, расположенную в рамке ДНК оригами. Связывание TFO приводит к объединению двух дуплексов, идущих вдоль центра кадра, в X-образную структуру, которая визуализируется с помощью AFM. Адаптировано из (93) с разрешения. ( D ) Триплексно-направленные каркасы кристалла треугольника тенсегрити с цианиновым красителем. Адаптировано из (94) с разрешения.

Совсем недавно мы расширили эту стратегию до нацеливания на более сложную структуру, собранную с помощью перекрестного обмена цепей; плитка и массив с двойным пересечением (рисунок) (91).До этих исследований мы были обеспокоены тем, что плотно упакованная природа спиралей и непосредственная близость кроссоверов могли препятствовать связыванию олигонуклеотида. Был выбран массив AB-типа, так как он позволял сначала исследовать взаимодействие TFO с отдельными плитками (т.е. только плиткой A) с помощью простых электрофоретических, термических анализов денатурации и ферментативной защиты с последующей направленной визуализацией его взаимодействий с расширенной плиткой. сборки с помощью AFM (т.е. как плитки A, так и B в массиве типа AB) (рисунок).Эти исследования показали, что TFO способен специфически взаимодействовать с плиткой и массивом и что сайты связывания доступны в последовательностях олигопурина, расположенных внутри перекрестных и неперекрестных цепей, и, что интересно, в области, которая охватывает само соединение. Последнее возможно, поскольку связывание TFO внутри большой бороздки является асимметричным, при этом олигонуклеотид распознает только олигопуриновую последовательность дуплекса, который был расположен вдоль неперекрестной цепи соединения.Насколько нам известно, это был первый пример тройного спирального кроссовера, который дает возможность создавать структуры, основанные на этом мотиве. Что еще более важно, эти исследования также продемонстрировали, что связанный TFO способен рекрутировать белок (стрептавидин) в наноструктуру ДНК посредством его взаимодействия с группой биотина, присоединенной к концу олигонуклеотида. Благодаря дизайну это привело к периодическому размещению белка на матрице с повторяющимся интервалом 32 нм в направлении, в котором плитки соединяются (желтые сферы; рисунок).Другой интервал должен быть возможен в соответствии с дизайном плитки. Например, наименьшая теоретическая стабильная плитка DX генерируется с разделением 16 пар оснований между концами спирали (т. Е. Половина и один полный оборот между пересечениями внутри или между плитками, соответственно), а расположение отдельных участков связывания в соседних плитках даст интервал повторения 5,5 нм. Использование тайлов систем типа AB, ABC и ABCD, где только тайл A содержит сайт привязки, увеличит интервал между повторами до 11, 16.5 и 22 нм соответственно (92).

Группы Сугияма и Эндо также исследовали образование триплекса в контексте структуры ДНК-оригами (93). Целью данного исследования было не продемонстрировать целенаправленную модификацию структуры как таковой , а визуализировать сам процесс образования триплекса. Для этого группы создали рамку ДНК-оригами, состоящую из двух смежных, но разделенных двойных спиралей, проходящих через центр рамки (рисунок). Они были сконструированы таким образом, что триплекс образовывался посредством ассоциации двух одноцепочечных областей внутри спиралей при добавлении либо его R-цепи, либо третьей цепи.При этом две спирали сводятся вместе и образуют X-образную структуру в центре кадра, которую можно получить с помощью АСМ. Наблюдалось образование как параллельных, так и антипараллельных триплексов, причем первые, как и ожидалось, зависели от pH раствора. В элегантной адаптации к этому исследованию авторы также контролировали ассоциацию TFO в реальном времени с помощью высокоскоростной АСМ. Для этого TFO был модифицирован фотокардируемой группой (N3-6-нитропиперонилоксиметилтимидин), которая предотвращает связывание TFO до воздействия УФ-света.В их экспериментальных условиях образование триплекса происходило за секунды.

Композиции в 3D

Одной из самых интересных структур, разработанных в последние годы, является кристалл треугольника тенсегрити, описанный Мао и Симаном (8,15). Треугольник тенсегрити представляет собой устойчивый мотив, состоящий из трех двойных спиралей, направленных вдоль линейно независимых векторов (8). Заклеивая спирали липкими концами, каждый треугольник может ассоциироваться с шестью другими в трех разных направлениях, давая макроскопические кристаллы ДНК (рисунок) (15).Кристаллы собраны из треугольников, содержащих от двух до четырех витков спирали на ребро, и имеют ромбоэдрические полости с размерами, превышающими 1000 нм ³ . Поэтому кажется вероятным, что они смогут вместить множество компонентов, начиная от небольших молекул и заканчивая нанокластерами и более крупными макромолекулами, такими как белки. Следовательно, мы исследовали триплексную адресность кристалла треугольника тенсегрити для создания каркаса молекул в трехмерном пространстве (рисунок).Поскольку треугольники могут быть собраны с трехкратной вращательной симметрией и без нее, мы продемонстрировали избирательное нацеливание на треугольники с сайтами связывания, встроенными в одну или три двойные спирали, соответственно (94,95). В обоих случаях треугольники, связанные с TFO, были способны к самоорганизующемуся росту кристаллов и вырастали до ожидаемых размеров и морфологии. Интересно, что мы также продемонстрировали сборку триплекс-модифицированного кристалла в одном горшке, используя медленную скорость ассоциации TFO; отжиг треугольника с высокой скоростью перед стадией кристаллизации позволил двумспиральным областям треугольника сформироваться до связывания TFO и, по-видимому, не повлиял отрицательно на рост или морфологию кристаллов.Более того, эти исследования показали, что TFO можно использовать для включения ненуклеиновых компонентов в асимметричную элементарную ячейку кристалла (т.е. одну треть треугольника). Например, присоединение цианинового красителя к концу TFO привело к ожидаемому изменению цвета кристалла (например, присоединение Cy3 привело к появлению красного кристалла; рисунок). Эти эксперименты были проведены с использованием немодифицированных и модифицированных TFO, содержащих аналоги нуклеозидов 2′-аминоэтокси-T и 2′-аминоэтокси-C, которые помогают облегчить зависимость образования триплекса от pH и позволяют модифицировать кристалл при нейтральном pH.Система треугольников, которую мы использовали здесь, содержала по три спиральных витка на край, и нацеливание одного компонента на каждую спираль внутри кристалла диктует его позиционирование с субнанометровой точностью; каждый компонент отделен от до . 10,5 нм вдоль оси спирали между плитками и 5,8 нм в трехмерном пространстве внутри той же плитки (то есть между 5 ’концами каждого TFO). Поскольку типичный кристалл размером 100 мкм содержит примерно 10 ¹² элементарных ячеек, полное заполнение каждого участка связывания внутри кристалла приведет к включению такого же количества периодически повторяющихся компонентов внутри кристалла, что приведет к локальной концентрации мкл. .10 мМ. Другие интервалы также должны быть возможны за счет использования треугольников с двумя или четырьмя спиральными витками на край (15) или, альтернативно, за счет использования кристаллических систем типа AB с сайтами связывания TFO, расположенными на каждой второй плитке в трехмерной решетке (96). Такие модифицированные кристаллы, вероятно, предложат приложения, которые включают организацию наноэлектроники, управление биологическими или химическими каскадами и определение структуры периодически расположенных молекул с помощью анализа дифракции рентгеновских лучей.

Для повышения стабильности структуры

Одним из основных недостатков создания наноструктур посредством W – C-гибридизации является то, что она включает обратимые нековалентные взаимодействия, ограничивающие применение этих структур при относительно низких температурах, в условиях, способствующих образованию стабильной водородной связи ( я.е. специфические ионные условия, pH и т. д.). Это особенно проблематично для расширенных структур на основе плиток, удерживаемых вместе короткими липкими концами, таких как системы треугольников DX и тенсегрити, описанные выше (14,15). Последнему также препятствует необходимость увеличения ионной силы во время кристаллизации; Удаление кристаллов в физиологический или другой подходящий буфер невозможно, так как это снижает их стабильность, что приводит к растворению кристаллов. Самый простой способ преодолеть эту проблему — повысить стабильность дуплексных областей, образованных слипанием липких концов, путем связывания третьей цепи через эти сайты (т.е.е. Связывание TFO через шахматные ник-сайты в дуплексе). Образование триплекса также может увеличить жесткость на кручение (97) нижележащего дуплекса. Мао с соавторами использовали этот подход для увеличения стабильности кристалла треугольника тенсегрити путем включения соответствующего участка через 2-нуклеотидные липкие концы между плитками кристалла (98). В отсутствие TFO кристаллы ДНК были стабильны только в растворах с высокой ионной силой (например,> 1,2 M (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ), в то время как в его присутствии кристаллы были стабильны при очень низкой ионной силе. как у 0.02 М раствор (Nh5) ₂ SO ₄ . Что еще более важно, эта стратегия может быть реализована после сборки кристалла путем пропитывания кристаллов TFO, минимизируя любое влияние на процесс сборки кристалла.

Мы разработали другую стратегию улучшения стабильности наноструктур, которая включает в себя направление реакций перекрестного связывания с лежащей в основе ДНК с помощью фото-перекрестно-связывающего агента 4,5,8-триметилпсорален (псорален) (95,99). Интеркаляция свободного псоралена на стадиях TpA приводит к реакции циклоприсоединения 2 + 2 с соседними тимидинами под воздействием УФ-излучения, тем самым сшивая две цепи дуплекса.Действительно, эксперименты показали, что сшивание может повысить термостабильность наноструктур, собранных с помощью ДНК-оригами (100). Однако множественные события интеркаляции плохо переносятся более мелкими мотивами, такими как DX или мотив треугольника тенсегрити, поскольку он раскручивает ДНК и нарушает точное позиционирование кроссовера, необходимое для сборки плитки и / или решетки. Таким образом, мы продемонстрировали, что TFO можно использовать для преодоления этого ограничения, направляя специфическое фото-перекрестное связывание псоралена в уникальные локусы в наноструктуре путем его присоединения к концу олигонуклеотида.Это было достигнуто путем встраивания соответствующей олигопурин-олигопиримидиновой последовательности с соседней ступенью TpA, расположенной на 5′-конце целевой последовательности TFO (рисунок). Размещение последовательности по областям, которые охватывают липкие концы между плитками как DX, так и треугольной системы тенсегрити (например, рисунок), привело к их сшиванию под воздействием УФ-излучения (95,99). Последнее было особенно выгодно, поскольку приводило к увеличению термической стабильности кристалла; нацеливание только на одну из трех спиралей привело к увеличению температуры плавления кристалла на –.8 ° С. Важно отметить, что воздействие ультрафиолета не нарушало сборки кристаллов. Стабильность кристаллов может быть дополнительно улучшена путем разработки системы, которая перекрестно связывает межмолекулярные контакты на каждом конце всех трех спиралей внутри треугольника. Такие ковалентно закрытые кристаллы могут оказаться полезными для применений, которые влекут за собой удаление кристаллов из маточного раствора. Эти исследования также подчеркивают, что образование триплекса можно использовать для направления любой реактивной группы, совместимой с синтезом олигонуклеотидов, в уникальные места в наноструктуре ДНК, например, в агент расщепления ДНК (31,32).Можно предположить, что, используя «ящик для инструментов» таких малых молекул-олигонуклеотидных конъюгатов, можно будет реконфигурировать множество наноструктур ДНК в топологии, ранее недостижимые только с помощью W – C-гибридизации.

Триплекс-направленная модификация наноструктур ДНК: ( A ) триплекс-направленная интеркаляция и фото-перекрестное связывание связанной молекулы псоралена со стадией TpA, введенной рядом с целевой последовательностью TFO. УФ-облучение приводит к реакции циклоприсоединения 2 + 2 с соседними тимидинами (показаны голубым), тем самым сшивая две цепи.( B ) Соответствующее нацеливание на шаг TpA и целевую последовательность, внедренную между соседними плитками кристалла треугольника тенсегрити, позволяет сшивать липкие концы и увеличивает стабильность кристалла. Адаптировано из (95) с разрешения.

ПЕРСПЕКТИВЫ: ТРЕТЬЯ НОВА ДЛЯ НАНОТЕХНОЛОГИИ ДНК?

Триплексы нашли наибольшее применение в структурах на основе олигонуклеотидов и плиток, поскольку целевые последовательности олигопурин-олигопиримидин могут легко быть встроены в области двойной спирали структуры с небольшим влиянием на топологию наноструктуры.Это контрастирует с их включением в структуры, собранные с помощью подхода ДНК-оригами, который ограничен ограниченным числом присутствующих в природе целевых последовательностей, расположенных в каркасе M13mp18: простой анализ последовательности выявляет три потенциальные последовательности олигопурина длиной более десяти нуклеотидов и около 13, которые содержат одно или два прерывания пиримидина. Одним из способов увеличения числа подходящих последовательностей может быть использование третьих цепей, содержащих аналоги оснований, предназначенные для распознавания пиримидиновых оснований (36,37).Также должно быть возможно удалить проблемные пиримидины в каркасе с помощью стандартных процедур клонирования или мутагенеза или, альтернативно, внутри цепей штапеля путем создания несовпадающих пар оснований, то есть путем создания несовпадений AG, GG, AA или GA. Последнее существенно увеличило бы количество целевых последовательностей с небольшой потерей стабильности оригами (47). Другой стратегией было бы включение соответствующих сайтов связывания в дуплексы шпильки или гантели, выступающие над поверхностью наноструктуры (4).Тогда количество возможных сайтов связывания будет зависеть от количества выступов на скобу, а также от общего количества модифицированных скоб (> 250 сайтов), необходимых для сборки оригами.

Существует множество модификаций оснований, сахаров и остова, которые можно использовать для улучшения триплексообразующих свойств олигонуклеотидов, таких как их аффинность связывания, зависимость от pH и кинетика, а также каталог таких модификаций, совместимых со стандартным химическим составом фосфорамидатов. постоянно расширяется (36,37).Использование таких модификаций предлагает возможность тонкой настройки связывания третьей цепи способом, который уже наблюдался с дуплексными модификациями (101, 102). Один интересный класс модификаций олигонуклеотидов, которые могут быть применены в этой области, — это пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), в которых фосфатный остов заменен незаряженными повторяющимися (2-аминоэтил) глициновыми единицами, с которыми нуклеиновые основания связаны метиленовыми мостиками (103,104). ПНК может быть запрограммирована на взаимодействие с ДНК посредством образования стандартного триплекса (103), но, что более интересно, может также взаимодействовать с дуплексами посредством смещения цепи и образования P-петли.В этом случае две пиримидин-содержащие нити ПНК взаимодействуют с пурин-содержащей нитью дуплекса-мишени, образуя локальный триплекс (104). Полученный триплекс намного более стабилен, чем эквивалентный триплекс ДНК, из-за более низкого отталкивания зарядов и может снизить концентрацию противоионов, необходимую для стабилизации таких структур.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Финансирование платы за открытый доступ: Эта работа была поддержана грантом BBSRC BB / H019219 / 1 для D.A.R.

Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

100 лучших квартир в Вашингтоне, округ Колумбия (с фотографиями)!

«Вашингтон — город южной работоспособности и северного очарования». (-Джон Ф. Кеннеди).

Вашингтон, округ Колумбия, как столица страны, несомненно, является желанным местом для жизни. В городе есть бесчисленные известные достопримечательности, памятники и сооружения, которые на протяжении сотен лет очаровывают жителей и туристов Вашингтона, округ Колумбия. Однако сюда привлекает не только богатая история и культура города.Вашингтон, округ Колумбия, также известен великолепной ночной жизнью, прекрасными торговыми районами и разнообразной кухней. Процветающая экономика также предоставляет широкие возможности для трудоустройства. Если вы думаете о переезде в Вашингтон, округ Колумбия, то вам необходимо знать основную информацию об основных районах города. Это руководство даст вам краткое изложение всех лучших районов.

Адамс Морган — один из D

«Вашингтон — город южной эффективности и северного шарма». (-Джон Ф.Кеннеди).

Возникли проблемы с Craigslist DC? Не можете найти эту особенную квартиру для аренды в Поиске квартир или в Гиде по квартирам? Список квартир здесь, чтобы помочь!

Добро пожаловать в Вашингтон, округ Колумбия

Вашингтон, округ Колумбия, как столица страны, несомненно, является желанным местом для жизни. В городе есть бесчисленные известные достопримечательности, памятники и сооружения, которые на протяжении сотен лет очаровывают жителей и туристов Вашингтона, округ Колумбия. Однако сюда привлекает не только богатая история и культура города.Вашингтон, округ Колумбия, также известен великолепной ночной жизнью, прекрасными торговыми районами и разнообразной кухней. Процветающая экономика также предоставляет широкие возможности для трудоустройства. Если вы думаете о переезде в Вашингтон, округ Колумбия, то вам необходимо знать основную информацию об основных районах города. Это руководство даст вам краткое изложение всех лучших районов.

Адамс Морган

Адамс Морган — один из самых модных районов округа Колумбия. Этот район, расположенный к северу от центра города, славится фантастической ночной жизнью и множеством ресторанов и баров вдоль коридора 18-й улицы.Люди, которые хотят весело провести вечер, стекаются в этот район. Магазины в этом районе тоже отличные. Магазины стильной одежды, такие как Urban Dwell, Commonwealth и Meeps, регулярно собирают большие толпы покупателей, ищущих следующую отличную покупку. Йога также очень популярна в этом районе, и в Адамс Морган есть множество студий горячей йоги и традиционных студий. Великолепные художественные галереи и залы для представлений, такие как Центр искусств Вашингтона, завершают этот район и обеспечивают еще больше развлечений.В целом, это очень интересное, модное и оживленное место, которое можно назвать своим домом.

Капитолийский холм

Капитолийский холм — это район Вашингтона, где расположены многие из самых известных достопримечательностей города. Например, здание Капитолия США, Верховный суд, Библиотека Конгресса и Ботанический сад США расположены в районе Капитолийского холма. Если вы хотите жить в самом историческом районе Вашингтона, округ Колумбия, и в том, который имеет наибольшую политическую активность, тогда вам стоит заглянуть в этот район.Если вы молодой профессионал, который хочет сделать карьеру в политике, вы найдете здесь массу возможностей.

Практически везде, где вы идете в этом районе, есть прекрасная возможность сделать селфи на фоне известной достопримечательности. Однако этот район также является магнитом для туристов. Так что, если вы не любите ежедневно общаться с туристами, возможно, это не лучшее место для вас.

Анакостия

Анакостия — это причудливый маленький район, который можно найти на юго-восточной стороне Вашингтона Д.C. Этот район более тихий, чем некоторые районы, расположенные в непосредственной близости от центра города. Тем не менее, у него очень богатая история, и здесь есть чем заняться и что посмотреть. В Анакостии находится дом Фредерика Дугласа, известного аболициониста. Вы также можете найти Общественный музей Анакостии и Развлекательную спортивную арену. Развлекательная спортивная арена является домашним местом проведения Вашингтонских мистиков и столичного гоу-гоу. Это также тренировочная база Вашингтонских Волшебников.В Анакостии много красивых велосипедных маршрутов, а на набережной Капитолия вы также можете арендовать каяки.

Брукленд

Район Брукленд в Вашингтоне, округ Колумбия, находится на северо-востоке города. В этом районе находится Католический университет. Его часто называют «Маленьким Римом» из-за обилия церквей, часовен и монастырей, которые можно найти здесь. Самая большая римско-католическая церковь в Северной Америке также находится в Брукленде. Эта церковь называется «Базилика национального святилища Непорочного зачатия».«Брукленд является домом для многих студентов и художников.

Если вы прогуляетесь по улице искусств на рынке Монро-стрит, вы увидите работы местных художников, гончаров и ремесленников. Эта работа впечатляет, и вы можете просто захотеть купить что-нибудь для своей новой квартиры. Если вы любите пивоварни, то, вероятно, вам также понравится Брукленд, потому что здесь есть несколько отличных пивоварен, в том числе Бруклендский дегустационный зал и Общественный фонд Смита. Загляните в этот район, если вы ищете более тихий район для жизни.

Центр города

Даунтаун — один из самых популярных и важных районов округа Колумбия. Да, Белый дом здесь, но в центре города находится множество замечательных достопримечательностей. Здесь вы найдете множество элитных ресторанов и баров, Смитсоновский музей американского искусства, галерею Ренвика и Национальный музей женщин в искусстве. Есть также захватывающие магазины в центре города, округ Колумбия, под заголовком CityCenterDC. В CityCenterDC есть множество элитных брендов одежды и ювелирных украшений, а также небольшие бутики.По сути, центр города — один из самых интересных и оживленных районов Вашингтона. Если вам нравится быть в центре событий, то это место для вас, и у вас будет масса возможностей для этого.

Колумбия-Хайтс

Колумбия-Хайтс — очень привлекательный район, расположенный в северной части Вашингтона, округ Колумбия. Этот район является прекрасным местом для молодых семей, так как он полон тихих, мирных улиц и великолепных парков. Например, вы посетите парк Меридиан-Хилл в Колумбии-Хайтс.В этом живописном парке много открытых зеленых насаждений, а также водные объекты, которые вас удивят. В Колумбии-Хайтс также есть много вкусных ресторанов, таких как популярные Thip Kao и Bad Saint. Испанский театр GALA и Мексиканский институт культуры также можно найти в Колумбия-Хайтс. Разнообразный район — отличное место, которое можно назвать своим домом.

Бунгало на Pine Cliff Apartments — Flagstaff, AZ

Ограничения: Тоса-ину / Кен, американский бандаж, кане корсо, ротвейлер, доберман, питбуль, бультерьер, стаффордширский терьер, аргентинский дог, бур-бул, чайка донг, басенджи, мастиф, перро де Преса Канарио, фила бразильеро, волк гибрид, Кавказская учарка, аляскинские маламуты, кангал, немецкая овчарка, овчарка, чау-чау, шпиц, акита, рептилии, кролики и пузатые свиньи.Смешанные породы, содержащие эти родословные, также запрещены.

• Интервью с домашним животным

  Не требуется

• Стерилизовано / стерилизовано

  Не требуется